[科普中国]-[原创]酶抑制法快速检测蔬菜农药残留技术

检测蔬菜农药残留有规范依据可循，遵循检测原理，在特定的检测环境下按照相应的检测原理逐步展开。1.标准依据基于酶抑制原理的蔬菜农药残留快速检测技术标准主要有3种：NY/T 448-2001《蔬菜上有机磷和氨基甲酸酯类农药残毒快速检测方法》、GB/T 5009.199-2003《蔬菜中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留量快速检测》、GB/T 18630-2002 《蔬菜中有机磷及氨基甲酸酯农药残留量的简易检验方法（酶抑制法）》。抽样过程依据标准为：NY/T 762-2004《蔬菜农药残留检测抽样规范》、GB/T 8855-2008《新鲜水果和蔬菜取样方法》。2.检测原理根据有机磷和氨基甲酸酯类农药能抑制乙酰胆碱酯酶活性，影响神经冲动传导，从而使动物中毒的原理，蔬菜提取液中有机磷或氨基甲酸酯类农药残留浓度与胆碱脂酶活性的抑制率呈正相关。如果蔬菜的提取液中不含有机磷或氨基甲酸酯类农药，加入的乙酰胆碱酯酶活性就不被抑制，实验中加入的底物会被酶水解，水解产物与显色剂反应变成黄色物质。如果提取液中含有能抑制乙酰胆碱酯酶活性的农药，就最终会影响黄色物质产生。测定检测液在410 nm处吸光度随时间的变化值，可以计算出抑制率，据此判断样品中有机磷或氨基甲酸酯类农药是否超标。3.检测环境检测仪和检测试剂对检测环境都有一定要求。酶抑制法的核心是酶的活性，室温太低会影响酶的活性，所以检测室最好安装空调，室温保持在20℃以上。检测仪要放置在稳定的工作台上，周围不能有振动源，尤其不能和振荡器放置在同一工作台上。检测室交流电源必须稳定，接地良好，检测仪不能和其他大功率电器共用电源，电压不稳会造成检测仪内部测量误差，最好用UPS电源以确保电压稳定。4.试剂的配制、保存4.1 试剂的配制试剂配制不当和变质是检测过程中最常见的问题。配制缓冲液时经常会发现磷酸盐结块，可以提前配制，静置1 d以后能自然溶解，稍加搅拌就可使用。配制酶溶液时，可以缓慢摇匀，但要避免形成泡沫，因为酶在泡沫的表面张力作用下很容易失活。不可大力振摇，液体振摇时的剪切力也能破坏酶的活性。也不能振摇太长时间，液面的表面张力能使酶变性，振摇次数太多，会使处于液面的酶不断更新，造成更多的酶分子失活。4.2 试剂的保存试剂配制前应冷冻保存,配制后的试剂可以在冷藏室短期保存，但要注意保质期。胆碱脂酶在0℃~5℃冷藏保存期是4 d，底物的冷藏保存期是2周，显色剂可以在冷藏室保存1个月。如果配制好的酶和底物在短期内不能用完，可以分二三瓶冷冻保藏，用时只解冻其中一瓶，反复冻融会造成酶的失活。需要注意的是，底物也很容易变质，底物变质对检测结果的影响与酶失活的影响是相似的，配制好的底物也应冷冻保存。4.3 试剂的使用试剂从冷藏室取出用于检测时，应放置10 min以上平衡至接近室温。如果是从冷冻室取出的酶试剂，应在全部融解后再使用，只倒出融化的一部分使用，其中的酶浓度会明显低于全部融解后的浓度。5.样品抽取抽取样品要注意样品的代表性。基地样品应抽取成熟或即将上市的蔬菜，要抽取混合样品。抽取批发市场样品要选择在交易高峰期进行，从不同堆层和堆高处取样。抽样过程中要详细记录样品的各类信息并经被抽样单位或个人确认以利统计及追溯。详细要求，以NY/T 762-2004《蔬菜农药残留检测抽样规范》，或GB/T 8855-2008《新鲜水果和蔬菜取样方法》为准。6.样品前处理6.1 样本制备实验室样本制备时，应选择两三个不同的有代表性的蔬菜个体，避开腐败、枯萎的部位和蕊叶，剪切有代表性的部分。果菜豆菜类要从不同个体的表皮至果肉1 cm处取样，然后混合称量。样品不要切得太碎，以小于1 cm的方块为宜。对一些有严重辛辣物质的蔬菜比如生姜，可以剪切尺寸接近直径1 cm的凸起部位，缩小切口面积，减少对酶活性的抑制。6.2 样本提取样品提取时间不同，溶出的农药量不同。应统一震荡提取1~2 min，倒出提取液静置3~5 min澄清，如果液体较为混浊，需用滤纸过滤。然后吸取上清液注入比色皿或酶标板测试孔内。如果用玻璃比色皿，最好用同一套比色皿，以免有色差造成吸光度差异。如果比色皿长期使用后有盐分或色素沉积，也会影响检测结果，需用稀盐酸浸泡清洗干净再用。6.3 检测液培养比色皿加入样品提取液后马上加入酶液和显色剂，如果采用的是丁酰胆碱脂酶，需在37℃~38℃培养30  min。如果采用的是乙酰胆碱脂酶，应在37℃培养15 min，如果室温低，可多培养几分钟，但同一批样品培养时间应一致。7.移液操作移液是检测工作的一项基础操作，如果移液操作不当，可以给检测结果带来很大的误差。吸取试剂时，应将吸头伸入液面3~6 mm垂直吸取，吸头移出液面时悬停1~3 s，慢吸慢放，确保吸头外壁不沾液体。排液时应将吸头倾斜抵在比色皿，缓慢压至第一档排出液体，等待1~3 s后，压到第二档排出剩余液体，防止液体溅出或挂在吸头上。8.上机检测对从培养箱取出样品到上机检测这段时间要严格把握。丁酰胆碱酯酶稳定性较差、活性较高，加入底物后反应速度快，吸光度值随时间变化大，所以应尽量缩短操作时间，否则会造成较大误差；乙酰胆碱酯酶则较为稳定，受操作时间长短的影响不大，对操作速度不必过于要求。9.结果判断如果采用的是NY/T 448-2001标准规定的丁酰胆碱脂酶法，抑制率≥70%为阳性结果；如果采用的是GB/T 5009.199-2003标准规定的乙酰胆碱脂酶法，抑制率≥50%为阳性，对于阳性样品需要重复检测2次以上才可下定论。此外，还要注意同一次检测结果是否全部偏大、全部为0或全部负值，这些结果都可能是不正常的系统误差，往往与检测仪是否预热、室温是否偏低、培养时间过长过短、试剂是否储存不当、提取时间过长过短有关系，需要根据实际情况分析原因，并验证纠正。 编辑：郝丽霞审核专家：山西省农机化技术推广总站高级工程师 张玉峰