[科普中国]-厌氧菌的分离与鉴定-

厌氧菌的分离与鉴定是对氧敏感度高的细菌进行分离与鉴别的试验，因为厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，他们的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。

正常值体内菌群的种类和比例正常，人体处于动态平衡健康状态。

临床意义下面主要介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术。

异常结果：由厌氧梭状芽胞杆菌所致的特殊病症如气性坏疽、破伤风、肉毒中毒等需要检查的人群：有糖尿病，严重肝病，肝硬化，尿毒症，褥疮溃疡，肢体坏疽，肉毒中毒等症状的患者。

注意事项在进行厌氧菌分离鉴定的过程中，需注意下述事项。 (1) 厌氧标本在采集和运输的过程中必须与空气隔绝，务必在30min内完成，同时应避免正常菌群的污染。 (2) 培养基要新鲜配制，若储存太久，有氧气溶解在表面或有过氧化物在培养基中，不利于厌氧菌生长。 (3) 若菌落太小，需用放大镜观察菌落。 (4) 做耐氧试验，要求从每个琼脂平板上挑取4-5个性状不同的菌落，分别接种需氧和厌氧血琼脂平板，置于需氧、二氧化碳和厌氧环境中培养。 (5) 如做胞外酶鉴定，一定要有足够的菌液浓度

检查过程分离

(1) 编号取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5。

(2) 稀释在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其混合均匀，制成10-1稀释液。用无菌注射器吸取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中，制成10-2稀释液。依此进行10倍系列稀释，至10-6，制成不同样品稀释液。通常选10-4、10-5、10-6三个稀释度进行滚管计数。

(3) 滚管分离

① 滚管将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒温的水浴中，待用，当培养基从瓶中取出时，要用N2在培养基内中充气。再在试管中用N2充气，赶走所有管内空气，然后把培养基加入管内，立即塞上瓶塞。待瓶塞塞入管内，及时拔出充气针头。用无菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0 .1mL，分别注入待用的试管中，然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动，带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层。

② 分离纯化生成的菌落需挑取出来，镜检其形态及纯度。如尚未获得纯培养物，需再次稀释滚管，并再次挑取菌落，直至获得纯培养物为止。待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定，做好标记。然后将培养基试管固定于适当的支架上，打开试管胶塞，同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内。同时，另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头。将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内，找准待挑菌落，轻轻吸取，转移至液体试管内，加塞。37℃培养，培养24h或更长时间或待培养液混浊后检查已分离培养物的纯度。

③ 划线分离将试管橡皮塞的一端在火焰上灼烧一下，挨着打气针塞住管口，在针头快速取下前，通气15-20s，管口一端在火焰上烧片刻。旋紧管塞，划线后的卷管直立保温，使用CO2:H2=80:20,因为CO2比空气重，开启后管塞不致有空气残留。划线后的滚管，置34-37度下培养，便可长出菌落。

菌种的鉴定

(1) 糖发酵试验糖发酵实验是最常用的生化反应，在肠道细菌鉴定上尤为重要。绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大差异，有些细菌能分解糖并产酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体(如氢、甲烷、二氧化碳等);有些细菌只产酸不产气。例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气;伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖;普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。酸的产生可以利用指示剂来断定。在配制培养基时预先加入溴甲酚紫[pH5.2(黄色)—6.8(紫色)]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。

具体实验步骤： ① 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。 ② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。 ③ 24h后观察各管中液体颜色变化及产气情况。

(2) 蛋白质分解实验 ① 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。 ② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。 ③ 24h后各管分别进行米伦氏反应、吲哚反应、黄色反应和坂口反应等。

（3）淀粉水解实验

① 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。 ② 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。 ③ 24h后于各管中加入适量卢戈氏碘液观察淀粉的水解情况。

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本词条内容贡献者为:

马海梅 - 主任医师 - 北京清华长庚医院检验科