[科普中国]-共聚焦激光扫描显微

共聚焦激光扫描显微（英语：Confocal laser scanning microscopy，CLSM，LCSM）是一项高分辨率三维光学成像技术。主要特点在于其光学分层能力，即获得特定深度下焦点内的图像。图像通过逐点采集，以及之后的计算机重构而成。因此它可以重建拓扑结构复杂的物体。

详解共聚焦激光扫描显微（英语：Confocal laser scanning microscopy，CLSM，LCSM）是一项高分辨率三维光学成像技术。1主要特点在于其光学分层能力，即获得特定深度下焦点内的图像。图像通过逐点采集，以及之后的计算机重构而成。因此它可以重建拓扑结构复杂的物体。对于不透明样品，可以进行表面作图，而对于透明样品，则可以进行内部结构成像。内部结构成像上，图像质量在单台显微镜中就可以得到极大的提升，因为来自样品不同深度的信息未被重叠。传统显微镜能“看”到所有能被光投身到地方，而对于共聚焦显微镜，只有焦点处的信息被采集。实际上共聚焦激光扫描显微是通过对焦点深度的控制和高度限制来实现的。

共聚焦的原理早在1957年就由美国科学家马文·明斯基注册为专利，但实际上经过三十年的时间及相应专用激光器的发展，直至1980年代末这项技术才成为标准技术。1978年，托马斯和克里斯托弗·克莱默设计出一套激光扫描程序。该程序采用激光聚焦的方式逐点扫描物体三维表面，并通过类似于扫描电镜的计算机化手段生成图像。这一共聚焦激光扫描显微设计首次结合了激光扫描方法和荧光标记的生物样品三维探测。接下来的数十年内，共聚焦荧光显微发展成一项成熟的技术，尤其受益于阿姆斯特丹大学（University of Amsterdam），来自海德堡的欧洲分子生物实验室（European Molecular Biology Laboratory）及其业界伙伴的共同努力。

共聚焦显微镜提供了完整，厚实，活体标本的直接，无创，连续光学切片的能力，最小化样品制备以及横向分辨率的微小改善。生物样品通常用荧光染料处理，以使选定的物体可见。然而，实际的染料浓度可以很低，以最小化生物系统的干扰：一些仪器可以跟踪单个荧光分子。此外，转基因技术可以产生生成其自身荧光嵌合分子的生物（例如GFP，绿色荧光蛋白的融合体）用感兴趣的蛋白质）。共聚焦显微镜的工作原理是样品中的点激发（衍射极限点）和所得荧光信号的点检测。探测器上的针孔提供了阻挡离焦荧光的物理屏障。仅记录通风盘的对焦或中心点。光栅一次扫描一个样本允许通过简单地改变z焦点来收集薄的光学部分。可以堆叠所得到的图像以产生样本的3D图像。

用于水平扫描的显微技术市面上有四种类型的共焦显微镜：

共聚焦激光扫描显微镜使用多个镜子（通常沿x轴和y轴线性扫描2或3个）来扫描样品上的激光，并通过固定的针孔和检测器“扫描”图像。

旋转盘（Nipkow盘）共焦显微镜在盘上使用一系列移动针孔来扫描光点。由于一系列针孔平行扫描一个区域，因此与激光扫描显微镜相比，允许每个针孔在特定区域上悬停更长的时间，从而减少照射样品所需的激发能量。降低的激发能量减少了样品的光毒性和光漂白，使其成为用于成像活细胞或生物体的优选系统。

微透镜增强或双旋转盘共聚焦显微镜的工作原理与旋转盘共聚焦显微镜相同，只是在含有针孔的旋转盘之前放置含有微透镜的第二个旋转盘。每个针孔都有一个相关的微透镜。微透镜用于捕获宽带光并将其聚焦到每个针孔中，从而显着增加引入每个针孔的光量并减少旋转盘阻挡的光量。因此，微透镜增强型共聚焦显微镜比标准旋转磁盘系统更敏感。横河电机于1992年发明了这项技术。

**可编程阵列显微镜（PAM）**使用电子控制的空间光调制器（SLM），产生一组移动的针孔。SLM是包含像素阵列的设备，其具有可以电子调整的各个像素的一些属性（不透明度，反射率或旋光度）。SLM包含微机电镜或液晶组件。图像通常由电荷耦合器件（CCD）相机获取。

这些类共焦显微镜中的每一种都具有特定的优点和缺点。大多数系统要么针对记录速度（即视频捕获）或高空间分辨率进行了优化。共聚焦激光扫描显微镜可以具有可编程的采样密度和非常高的分辨率，而Nipkow和PAM使用由相机分辨率定义的固定采样密度。单点激光扫描系统的成像帧速率通常比旋转磁盘或PAM系统慢。商用旋转盘共聚焦显微镜的帧速率超过每秒50帧- 这是动态观察（如活细胞成像）的理想特征。

在实践中，只要针孔距离足够远，Nipkow和PAM就允许多个针孔平行扫描同一区域。

共焦激光扫描显微镜的前沿开发现在通过使用多个微机电扫描镜，可以比标准视频速率（每秒60帧）成像更好。

共聚焦X射线荧光成像是一种较新的技术，除了水平和垂直瞄准外，还可以控制深度，例如，在分析绘画中的埋藏层时。

本词条内容贡献者为:

刘军 - 副研究员 - 中国科学院工程热物理研究所