[科普中国]-牛羧肽酶原酶-

羧肽酶（CPs）是一种专一性地从肽链的C端逐个降解、释放游离氨基酸的一类肽链外切酶。在动物、植物的组织器官中，羧肽酶发挥着重要的生理功能。根据来源分类，羧肽酶可分为动物羧肽酶、植物羧肽酶和微生物羧肽酶。

牛羧肽酶原是牛羧肽酶的前体，牛羧肽酶原主要存在于哺乳动物的胰脏，经牛羧肽酶原酶激活后形成活性牛羧肽酶。牛羧肽酶原由前导肽部分和活性牛羧肽酶组成，二者通过牛羧肽酶原酶的激活位点相连，要注意激活时的温度及时间。若酶解过度，即牛羧肽酶原酶酶解牛羧肽酶其他位置氨基酸，使牛羧肽酶失活，导致酶活损失；若激活不够，即仍有部分以酶原形式存在，不能提高酶提取效率

羧肽酶羧肽酶（CPs）是一种专一性地从肽链的C端逐个降解、释放游离氨基酸的一类肽链外切酶。在动物、植物的组织器官中，羧肽酶发挥着重要的生理功能，如胰腺羧肽酶A和B可用于消化食物，羧肽酶M（CPM）选择性地参与肽类激素的加工，羧肽酶D（CPD）和羧肽酶N（CPN）参与肽和蛋白质加工等。羧肽酶广泛应用于医药、食品等工业领域。在医药领域，由于羧肽酶广泛参与机体的生化反应，可通过体内羧肽酶的检测达到诊断和治疗疾病的目的；此外，在医药上还可用于体内不良物质（毒素等）的降解。在食品工业，可用于制备高F值寡肽、食品和饲料中赭曲霉素的去除、用作脱苦味剂等。在生物技术领域，羧肽酶可用于多肽的合成及多肽氨基酸序列测定，也可作为模式酶，对其他酶的研究提供帮助。动物来源的羧肽酶主要存在于猪、牛等的胰脏中，如羧肽酶A/B，其数量非常有限、价格昂贵、导致其应用受到限制；微生物来源的羧肽酶存在于酵母、曲霉等真菌的液泡中，具有广阔的应用前景。因此，借助基因工程策略采用微生物为宿主大量生产重组羧肽酶，有望克服羧肽酶生产过程所遇到的动植物原料来源限制等限制，进一步降低生产成本、提高产品质量、深化酶学性质研究、扩展应用范围1。

羧肽酶的种类及特点根据羧肽酶活性中心含有丝氨酸残基、金属离子和半胱氨酸残基的不同，将羧肽酶分为丝氨酸羧肽酶、金属羧肽酶和半胱氨酸羧肽酶。

丝氨酸羧肽酶丝氨酸羧肽酶（SCP）又称酸性羧肽酶，是一类真核生物蛋白水解酶，亚基相对分子质量40000-75000，广泛存在于真菌、高等植物和动物组织中。在酸性环境下，丝氨酸羧肽酶具有末端蛋白水解酶、酯酶和脱酰胺酶的活性，可同时参与多肽和蛋白质的加工、修饰与降解。由于位切点不同，丝氨酸羧肽酶又分为溶酶体Pro-Xaa羧肽酶、丝氨酸D-Ala-D-Ala羧肽酶、羧肽酶C、羧肽酶D。其中，羧肽酶C因可水解所有具有羧基末端的氨基酸（羟脯氨酸除外），已成为蛋白质多肽链C末端分析中常用工具酶；此外羧肽酶C还可通过转肽反应将其它氨基酸衍生物或亲核物质以取代肽链末端的氨基酸残基从而形成新肽。在所有丝氨酸羧肽酶的活性位点中，含有1个由Ser、Asp、His按独特顺序构成的具有催化功能的结构单元，其中Ser是亲核位点、Asp是亲电子体、His是基底。这一结构单元可被异氟磷、甲苯磺酰丙氨酸和酮苯丙氨酸抑制。此外，丝氨酸羧肽酶活性被Cu2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+等金属离子抑制，Mg2+则促进羧肽酶活性。

金属羧肽酶金属羧肽酶是一类存在于细胞外，帮助蛋白质消化，在中性或弱碱性条件下具有极大活性的羧肽酶，包括：羧肽酶A、B、赖氨酸羧肽酶、甘氨酸羧肽酶和谷氨酸羧肽酶）等。其中，羧肽酶A能释放C末端氨基酸（除脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸和赖氨酸），对具有芳香族侧链和大脂肪侧链的羧基端氨基酸具有很强水解能力。相比较而言，羧肽酶A释放非极性氨基酸、组氨酸、苏氨酸、高丝氨酸等的速度比较快，但对天冬氨酸、丝氨酸、蛋氨酸以及赖氨酸等的释放速度则比较缓慢，但随着pH值的增加，对天冬氨酸、丝氨酸和蛋氨酸的作用速度也不断加快。羧肽酶A的催化需要锌离子参与，它是第一个被发现的金属酶和锌酶，正是因为如此，羧肽酶A是动力学、结构和光谱方法等方面研究最为清楚的水解酶，为其他锌酶的研究奠定了坚实的基础。羧肽酶B仅水解以碱性氨基酸（如精氨酸和赖氨酸）为C末端残基的肽键，大部分特性与羧肽酶A很相似，唯一不同点在于羧肽酶B对C－末端是精氨酸和赖氨酸残基的肽键具有很高的水解活性，有时也能切断其它疏水性氨基酸残基。pH8时羧肽酶B活性达到最大值，偏酸性和偏碱性的条件都会降低酶活，当pH≥12时，活性则完全丧失。

半胱氨酸羧肽酶半胱氨酸羧肽酶又称组织蛋白酶X、组织蛋白酶Z、酸性羧肽酶，是一类由Cys84、His233和Asn254组成活性中心，催化功能结构域中包含半胱氨酸（Cys）的羧肽酶。存在于牛、鲤鱼、人、小家鼠、褐牙鲆等动物的消化道、脑、眼、心脏、肝等组织的细胞液中，对C－末端氨基酸具有广谱活性，但对C－末端Pro无活性作用，内切酶活性很弱。

羧肽酶的来源及分布根据来源分类，羧肽酶可分为动物羧肽酶、植物羧肽酶和微生物羧肽酶。在哺乳动物的不同组织中含有一系列的金属羧肽酶，以执行相应的生理功能。如胰腺羧肽酶A和B主要帮助消化食物、羧肽酶E选择性地加工生物活性肽、羧肽酶M选择性地参与肽类激素的加工、羧肽酶D（高尔基体中）和羧肽酶N（血浆中）参与肽和蛋白质的加工。对动物源羧肽酶的研究，主要集中于人、猪、牛、小家鼠等。其中对人源羧肽酶的研究是为了解析羧肽酶在人体内的作用机制，以进行疾病的诊断、治疗；而对小家鼠羧肽酶的研究则是作为研究模型，以解析人源羧肽酶生理机制。动物源羧肽酶的另一主要研究领域是应用于胰岛素、多肽的工业化生产中。目前，已从大麦、小麦、拟南芥、水稻，番茄、绿豆等多种植物中分离到丝氨酸羧肽酶（SCP）及丝氨酸羧肽酶类蛋白（SCPL）的基因和蛋白，除参与催化蛋白水解反应、植物损伤应答反应外，还在油菜素内酯、芥子酰基苹果酸等化合物的合成中发挥积极的作用。微生物羧肽酶包括微生物自身生产的羧肽酶及以微生物为宿主过量表达的羧肽酶。已有研究表明，酵母、假单胞杆菌、曲霉等是微生物羧肽酶的主要来源，所生产的羧肽酶主要是丝氨酸羧肽酶，具有广泛的底物特异性。源于酵母细胞的羧肽酶Y是使用范围最为广泛的羧肽酶，用于将猪胰岛素B链末端的丙氨酞胺残基以苏氨酸残基取代，以半合成人胰岛素（通过羧肽酶的转肽作用）、蛋白序列的测定等；而源于假单胞杆菌的羧肽酶G可用于甲氨蝶呤解毒、AD-EPT。此外，研究发现存在于米曲霉、构巢曲霉、黑曲霉等真核微生物液泡中的羧肽酶，可用于多肽脱苦、生物活性多肽的延长或特异性修饰等。

牛羧肽酶原羧肽酶（CPs）是一种专一性地从肽链的C端逐个降解、释放游离氨基酸的一类肽链外切酶。在动物、植物的组织器官中，羧肽酶发挥着重要的生理功能。根据来源分类，羧肽酶可分为动物羧肽酶、植物羧肽酶和微生物羧肽酶。在哺乳动物的不同组织中含有一系列的金属羧肽酶，以执行相应的生理功能。如胰腺羧肽酶A和B主要帮助消化食物、羧肽酶E选择性地加工生物活性肽、羧肽酶M选择性地参与肽类激素的加工、羧肽酶D（高尔基体中）和羧肽酶N（血浆中）参与肽和蛋白质的加工。对动物源羧肽酶的研究，主要集中于人、猪、牛、小家鼠等。牛羧肽酶存在于牛的消化道、脑、眼、心脏、肝等组织的细胞液中。

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梁志宏 - 副教授 - 中国农业大学