[科普中国]-染色体畸变分析试齄

染色体畸变实验

细胞在有丝分裂中期，染色质逐渐变粗变短，而形成染色体，染色体的长短、大小、着丝点等特征较为显著，易观察。观察到的一切畸变均为来源于不能被修正或不能正常修复时的损伤，裂隙不应记为有意义的畸变，而由多个裂隙引起的易位、放射体环、多着色点等，为遗传性损伤指标。一般染色体断裂和再接合时，细胞在第一次分裂后不能再分裂而致死，而对称性的染色体单体互换、易位、缺失、遗传上可以存活的易位，这种细胞遗传的危害可能很大；当每个细胞发生多个染色体畸变比只有单个染色体畸变的损伤更加严重；最终遗传物质是否诱变力阳性时，应全面考虑畸变类型、频率和剖量关系。实验组与对照组相比，染色体畸变率有明显的剂量反应关系，差异有统计学意义，可确认为阳性结果1。

染色体畸变实验在新药评价中的应用应用研究背景日本将体外染色体畸变实验作为Ames实验的补充，这两项体外实验和一项体内实验(即小鼠骨髓细胞微核实验)作为新药短期致突变实验的基本组合，对新的工业化合物和农药的安全性评价也采用类似的方案。据文献报道，使用原代细胞或已建株的细胞系，用或不用代谢活化系统检测已知的致癌物约有39%为阳性，在Ames实验中为阳性的化合物，约79%在染色体畸变实验中也是阳性，而那些在Ames实验中为阴性的化合物，在染色体畸变实验中约有09%仍为阳性。上述结果说明在药物和化合物的短期致突变实验评价中，如果只做Ames实验，许多遗传毒性化合物将会被认为是无毒的。因此，体外染色体畸变实验对药物和各种化合物的潜在性遗传毒性的安全评价，是一个很有用的补充实验。但是在上述实验中，若有一种实验为阳性，在小鼠体内微核实验或致癌实验中，不一定是阳性。如果染色体实验和Ames实验均为阳性，特别是体内微核实验为肯定阳性时，常常在致癌试验中是阳性结果，土述三种致突变实验为判断肿瘤的发生预先提供了信息。

推荐使用的细胞有文献报道，采用已建立的细胞系或原代细胞，例如人外周血淋巴细胞或中国仓鼠肺成纤维细胞系(CHL)或中国仓鼠卵巢细胞系(CHO)为常用的实验材料。应用这些材料的优点是：（1）染色体的数目少，有利于计数分析，细胞的增殖周期短，在简单的培养基中能生长；（2）同一个细胞系可用于不同的实验；（3）细胞对S9活化相对稳定；（4）细胞对各种化合物是敏感的。美国国家毒理学计划(NTP)推荐使用CHO细胞系，日本工作者多使用CHL细胞系。

新药评价中染色体实验要求如下：（1）使用原代细胞或已建立的细胞系；（2）至少设计三个剂量组，首先选择抑制50%细胞生长浓度，当化合物无细胞毒性时，最高浓度应限定在10mmol/L；(3)设溶剂对照和已知断裂剂作阳性对照，加S9代谢活化和不加S9活化对照；（4）选用合适的代谢活化方法，如选用S9的浓度及合适的代谢活化时间等；（5）细胞经受试物处理后，选择合适的收获细胞时间。经受试物作用后细胞周期可能延迟，所以需要两个不同的取样时间。每个剂量组至少两个样本，每个样本观察100个中期细胞，分析染色体的数目异常和结构畸变；(6)列表统计出染色体畸变率及畸变类型，染色体畸变的分类应遵照国际公认的标准。染色体型畸变和染色单体裂隙应分别统计，对染色体和染色单体裂隙很难确定统一的标准，因此建议各研究者在报告中应注明自己的标准。

受试物处理与取样时间通过初试细胞毒性，选择合适的药物浓度，.药物对细胞的毒性及诱发染色体畸变常常是在很窄的剂量水平，经处理24-84h后，根据细胞生长状况判断细胞毒性。如果受试物对细胞无毒性，最大剂量可用2=3mg/mol然而对可溶性受试物(例如盐溶液)，最大浓度应限制在10mmol/L，因为通常在此浓度以上时，培养基中的渗透压开始增加，培养基的pH或渗透压的改变也许不会直接损伤染色体，但能间接地引起染色体畸变。对不易溶解的药物，建议用狡甲基纤维素钠(CMC)悬液作溶剂，因为这种粒子十分微小，能被吞噬细胞所利用。按照OECD对新药的评价标准，不易溶解的药物实验时应做到最大的溶解度，不能用乙醇作为实验溶剂，因为在培养基中乙醇被转化为乙醛，可能出现假阳性结果。

化合物与细胞的接触时间在实验中是一个关键问题，必要时可以连续处理，直到收获细胞，使细胞在整个实验中接触受试物。如果细胞生长不良或没有观察到中期分裂相，可更换新鲜的培养液培养。实验中使用S9混合物时，由于S9本身的细胞毒性作用，细胞不能长时间接触S9，根据1988年Ishidate介绍的悬孵培养法，细胞悬液与S9只能接触l-3h。而用另一种平皿培养法只是单层细胞接触S9，用这种方法细胞与S9接触可长达3-6h，这样可使某些化合物在低剂量水平即能诱发出较多的畸变。

收获细胞的最佳时间主要取决于使用的细胞种类，、原则上是要使所观察到的染色体畸变是在受试物处理后的第一个分裂中期。经受试物处理后细胞分裂周期可能延长，所以较长时间的培养可观察到更多的畸变。许多化合物处理48h比24h会引起更多的畸变。这一结果说明，选择不同的实验条件对所得结果可以产生很大的影响。染色体不稳定性畸变与稳定性畸变的关系大部分不稳定性畸变是致死性的，可能产生不了遗传效应2。