[科普中国]-乳清蛋白分离物

乳清蛋白分离物的概述

乳清蛋白是将牛乳pH降低至4.6时，沉淀去除酪蛋白时保留在上清液中的多种蛋白质组分的统称，包括β-乳球蛋白（2~4g/L）、α-乳白蛋白（0.6~1.7g/L）、牛乳血清白蛋白（0.2~0.4g/L）、免疫球蛋白（0.5~1.8g/L）、乳铁蛋白、乳过氧化物酶、糖巨肽以及生物活性因子和酶等1。

β-乳球蛋白（β-lactoglobulin,β-Lg）在乳清中含量较高，在乳清蛋白中占主要地位，约占乳清蛋白的50%，在乳中的含量约为3.2g/L。β-Lg等电点为pH5.2，相对分子质量约为18200，β-Lg有五种变异体：A、B、C、D、Dr。β-Lg由162个氨基酸组成，其二级结构有7~10%α-螺旋，43~51%反平行β-折叠，其余部分呈任意构象，β-Lg仅有两个二硫键和一个巯基基团。β-Lg在牛乳中以二聚体的形式存在（相对分子质量为36566），当pH8.5时β-Lg发生可逆解离，当pH变为10，β-Lg二聚体解离为单体，发生不可逆变性。

α-乳白蛋白α-乳白蛋白（α-lactalbumin,α-La）在牛乳中含量约为1.2g/L，约占牛乳总蛋白的3.5%，占乳清蛋白的20%左右。在初乳中含量较多，多达10%~12%。α-La具有两个变异体：α-LaA和α-LaB。α-La被紧密地折叠，基本上是球状分子。α-La以1.5~5μm直径的微粒分散在牛乳中，对酪蛋白起保护胶体作用。α-La等电点为pH4.7~5.1，相对分子质量为14175，含有8个半胱氨酸残基，形成4个分子内二硫键，结构很稳定。α-La的二级结构非常有序，有一个紧密的空间三级结构，α-La在抵抗热变性方面表现较为稳定。

牛血清白蛋白牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin,BSA）约占乳清蛋白的5%左右，等电点pH为4.9。BSA相对分子质量为66000，从牛乳中分离的血清白蛋白有两种遗传变异体。BSA不能在乳腺中合成，而是从血液流进，与血液中的BSA几乎无差别，由607个氨基酸组成，具有一个游离硫巯基（胱氨酸34）和17个二硫键，牛乳中的BSA都是由牛血清中转移而来。

免疫球蛋白免疫球蛋白（Immunoglobulin）是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似，能与相应的抗原发生特异性结合反应的球蛋白，是体液免疫的主要物质。牛乳中的免疫球蛋白包括IgG、IgA和IgM，在常乳中浓度较低，含量约为0.05%~0.11%，占乳清蛋白的5%~10%，而在牛初乳中浓度很高，含量高达15%，占初乳蛋白质的50%~60%。

分离乳清蛋白的主要技术手段目前，牛乳乳清蛋白的分离方法很多，其分类方法也很多，根据以下几点对牛乳乳清蛋白的分离纯化方法进行分类：1）根据乳清蛋白在某种溶液中（一般是酸碱或盐溶液中）溶解度不同而得到分离，例如等电点沉淀法、盐析法及有机溶剂沉淀法；2）根据乳清蛋白在相互相溶的溶剂中溶解度不同，利用一种溶剂把乳清蛋白从它与另一种溶剂所组成的溶液中提取出来的方法，例如有机溶剂萃取法、双水相萃取法、反胶束萃取法；3）根据乳清蛋白带电性质不同，利用层析柱材料与乳清蛋白离子交换亲和力的不同来分离不同组分蛋白，例如阴离子交换层析和阳离子交换层析；4)根据乳清蛋白与吸附材料的选择性吸附能力不同而分离，例如疏水作用层析、亲和层析及羟基磷灰石层析；5）根据乳清蛋白分子大小（分子量）不同，使不同乳清蛋白组分选择性地通过，以达到分离纯化目的，包括超滤技术和凝胶层析。

双水相萃取法双水相技术（Aqueous two-phase systems,ATPS）开始于20世纪60年代，1896年Beijerinck发现明胶与琼脂或明胶与可溶淀粉混合时，可以得到一个混浊不透明的溶液，随之分为两相，这个现象被称为聚合物的不相溶性，这就是双水相系统。1979年德国GBF的Kula等首次将双水相萃取分离技术应用于从细胞匀浆中提取蛋白质和酶类，大大改善了胞内酶的提取效果。过去的几十年，双水相体系（聚合物Ⅰ/聚合物Ⅱ或聚合物/无机盐体系）已广泛应用于多种蛋白质产品的分离纯化过程中。

凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法（Gel filtration chromatography,GFC）又称凝胶排阻层析或分子筛层析，是利用化学惰性的多孔网状结构的物质为固定相，通过洗脱液的洗脱，使混合物中的各种物质根据分子大小不同得到分离，在洗脱过程中，分子质量最大的物质无法进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙被洗脱最先流出柱外，而分子质量最小的物质可以进入凝胶网孔而受网孔的阻拦，缓慢洗脱出来，最后流出柱外。与其他色谱法相比，凝胶过滤色谱最大的特点是操作简便，适用于大规模分离纯化过程。但凝胶层析由于洗脱液洗脱会稀释样品，降低样品浓度，往往凝胶过滤层析后需要浓缩步骤。凝胶过滤层析具有所需设备简单、操作方便、分离迅速，溶质与介质不发生任何形式的相互作用，可以采用恒定洗脱法洗脱，操作条件温和，不影响样品的生物活性等优点，广泛应用于大分子物质的分离纯化

离子交换层析法离子交换层析（Ion exchange chromatography,IEC）是以离子交换树脂为固定相，通过流动相中离子与树脂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的不同而进行分离的一种层析方法。通过分子中的活性离子将溶液中带相反电荷的物质吸附在离子交换剂上，然后用适当的洗脱溶剂将吸附物质再从离子交换剂上洗脱下来，从而达到目的产物的分离和纯化的目的。离子交换剂中的活性离子是决定交换剂的主要性能，因此离子交换剂可以按照活性离子的性质进行分类。例如，目前常用的离子交换树脂中的活性离子带正电荷，则可与溶液中的阳离子发生交换，就称为阳离子交换树脂；如果离子交换树脂的活性离子带负电荷，则可与溶液中的阴离子发生交换，就称为阴离子交换树脂2。