[科普中国]-派生质粒

pSV2及其派生的质粒载体

大肠杆菌的Eco—gpt基因已经被克隆出来，并插入到各种不同的载体上，例如SV40晚期取代载体pSV2，构成新的重组质粒载体pSV2一gpt，使其置于SV40启动子的控制之下进行表达，因此有些作者也叫这种质粒载体为表达载体(图1)。猿猴细胞在感染上了这种质粒载体之后，便获得了表达Eco—gpt基因的能力，而且依据其对次黄嘌呤抑制作用的不敏感性和电泳迁移率的差别，就可以把这种外源的Eco—gpt表达产物，同内源的哺乳动物之HGPRT区别开来。

pSV2是在DNA肿瘤病毒SV40的基础上发展出来的一种新型的质粒载体家族。它是由从SV40早期转录单位派生出来的一种表达盒(expression cassette)，插入在pBR322质粒DNA上重组形成的。这个表达盒共有三个组件。第一个组件是Pvu Ⅱ—Hind Ⅲ区段，它含有SV40早期转录启动子及转录起始位点，但没有转译起始密码子ATG。这个组件的功能是启动插入在它的下游的外源基因进行转录；第二个组件是含有66bp长的小t蛋白质间隔子的DNA区段，其作用在于为异源的转录本提供一种剪辑给体及受体的位点；第三个组件是含有转录终止区及多聚腺苷酸化位点的DNA区段，起到终止转录反应和poly(A)加尾的功效。

pSV2质粒载体中另一种重要组成部分是pBR322质粒的DNA序列，包括一个原核的复制起点，和一个氨苄青霉素抗性(Ampt)选择标记。

外源的选择标记基因Eco—gpt，以及neo和dhfr，以保持正确读码结构的Hind Ⅲ—Bgl Ⅱ片段形式，定向插入到pSV2质粒载体的Hind Ⅲ和MboI克隆位点上(Bgl Ⅱ和MboI为同尾酶)，由此便产生出pSV2一gpt、pSV2一neo和pSV2一dhfr三种不同的质粒载体，其中大T间隔子序列被破坏掉了(图1)。这些质粒载体在哺乳动物基因工程中有着十分广泛的用途，为克隆的异源基因提供了便利的检测、选择及表达的手段1。

pRSV及其派生的质粒载体在发展出了上述这些以SV40启动子为基础的表达载体之后，科学工作者又发现在某些哺乳动物的细胞中，劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)启动子比SV40的具有更强的表达能力。RSV是一种单链RNA反转录病毒，它是经由双链DNA形式整合到寄主染色体上。RSV的启动子便是位于此种原病毒的长末端重复序列(LTR)中。现已分离到含有RSV启动子的长度为524bp的DNA片段。用此片段取代pSV2质粒载体中的Pvu Ⅱ—Hind Ⅲ(SV40启动子)区段，便构成了哺乳动物细胞的另一类表达质粒，即pRSV质粒载体系列，包括pRSV—gpt及pRSV—neo等(图2)。可能是由于在强启动子作用之下，这类质粒载体上的选择标记基因获得了更加有效的表达。因此应用此类质粒载体，显然可以得到相对较高的DNA转染效率2。

质粒载体质粒DNA是微生物细胞中分子量比染色体DNA小得多的共价、闭合、环状双链DNA分子(个别除外，如酵母自杀质粒是RNA)，是一种存在于染色体外的能自主复制的遗传因子，质粒通常带有与细胞的主要代谢活动无关的一些基因，例如抗生素抗性基因、产生细菌素的基因、糖类分解代谢的基因和诱发肿瘤的基因等等。由于质粒的存在，宿主细胞往往被赋予新的表型，当把一个含抗药性基因的质粒转入细胞之后．原来无抗药能力的细菌则表现出抗药新表型。

质粒的生物学性质：

(1)质粒的复制具备复制起点(原点)是DNA分子在宿主细胞中进行复制的一个必要条件。根据复制控制类型的不同，质粒分为严紧型质粒与松弛型质粒，前者受宿主细胞复制作用的严格控制，因此，每个细胞中只含有一至几个拷贝；而后者则受宿主细胞的控制不严，它们在每个细胞中的数目可达10—500个拷贝，当用氯霉素抑制细胞蛋白质合成时，质粒拷贝数可扩增至数千个。现在使用的质粒载体绝大多数都是松弛型质粒。

(2)质粒不相容性质粒不相容性(incompatibility)指在没有选择压力的条件下，两种亲源关系密切的质粒不能共存于同一宿主细胞中的现象。原因是它们的复制子相同，所用的复制系统也相同，故在复制和分配到子细胞的过程中互相竞争。细菌生长几个世代后，量少的质粒就完全消失。至今已发现30个以上的不相容组，只有属于不同不相容组中的质粒才能共同存在于同一个宿主细胞中3。

(3)选择标记 当质粒DNA转化宿主细胞时，只有极少部分宿主细胞接受了DNA，所以需要利用质粒编码的选择标己将转化成功的宿主细胞(阳性克隆)从大量的宿主细胞巾筛选出来。

质粒最常用的选择标记是抗生素抗性基因，这些抗性主要包括氨苄西林(Amp或Ap)、四环素(Tet)、氯霉素(Cm)、卡那霉素(Kan或Km)和新霉素(Neo)等，例如，对氨苄西林有抗性的质粒，一般写作Ampt；而对该药敏感的质粒则写作Amps。

含有氨苄西林抗性质粒的细菌之所以对氨苄西林产生抗性是由于氨苄西林抗性基因的编码产物是β一内酰胺酶，该酶存在于细菌的细胞膜与细胞壁之间，可将细菌周围的氨苄西林降解，从而使细菌生存下来、值得注意的是：抗生素抗性基因必须完整，才能表达出有活性的酶去破坏抗生素而使宿主菌表现出抗药性，如果把抗性基因切断、分开或改变，如在其中插入一段外源基因，则抗性基因便无法表达出有功能的酶而使抗生素失活，这种现象就叫做插入失活。利用插入失活可使细菌由耐药变为敏感的特点，可以对质粒是否插入了外源基因进行快速筛选4。