[科普中国]-双启动子表达载体

基因工程表达载体

在基因工程技术当中，克隆载体主要用来目的基因的数量扩增。当需要获得目的基因的表达产物时，则需要使用基因表达载体。在生物体内，完整的基因包括启动子区域、编码区域、终止区域，因此表达载体将外源基因在宿主细胞中表达成蛋白质，其必要条件是：①需要很强的启动子，并能被宿主细胞的RNA聚合酶识别并启动转录，这样保证基因大量表达；②需要很强的终止子，使得RNA聚合酶转录目的基因的序列而不是其他无关的序列；③目的基因的编码区必须具有翻译起始密码子ATG，原核表达载体还需要SD序列(图1)。

根据重组表达载体产生的蛋白存在形式，将表达载体分为融合型载体和非融合型载体。就一般情况而言，实验者是希望得到非融合蛋白。但是融合蛋白质有其优势，一方面，载体上的融合标签序列使得蛋白纯化变得容易，另一方面，融合序列可使蛋白的翻译效率提高，基因产物较为稳定。最后，融合蛋白可通过化学方法裂解成非融合蛋白。

基因表达载体有很多类型，如诱导型表达载体、反义基因表达载体、组织特异性表达载体、分泌型表达载体、双启动子表达载体等1。

表达载体应该具备的条件①能自我复制并能带动插入的外源基因同步复制。

②具有合适的限制性内切酶位点。在载体上单一的限制性内切酶位点越多越好，这样可以将不同限制性内切酶切割后的外源DNA片段方便地插入载体。

③具有合适的筛选标记，方便选择克隆子，如抗药性基因等。

④在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增。

⑤载体的分子质量要小。这样可以容纳较大的外源DNA插入片段。载体分子质量太大将影响重组体或载体本身的转化效率。

⑥在细胞内稳定性高，这样可以保证重组体稳定传代而不易丢失。

⑦基因载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，而且不会转入除受体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人的细胞2。

双启动子表达载体用于构建基因疫苗基因疫苗常用真核表达质粒作为载体。构建过程符合真核表达载体构建的一般原理。真核表达载体的数量和种类繁多，而且新的功能更强的载体不断涌现，其中pcDNA载体系列是应用最多、背景比较清楚的真核表达载体。目前，常用的有pcDNA—3.1、pcDNA—3.1一E、pcDNA3.1/Zeo(+/一)、pcDNA4、pcDNA4/HisMAX、pRc/RSV等多种。

这类载体用人巨细胞病毒早期启动子(CMV)和猴空泡病毒早期启动子(SV40)作为增强子——启动子元件。这类元件来源于病毒基因组，在很多真核细胞中都有很强的促进转录的作用。也有用来自RNA病毒如HIV、AMV、RSV和MMLV等反转录病毒的长末端重复序列(LTR)。这些病毒源的增强子一启动子元件中，以CMV和LTR的启动效率比较高。

也有用金属硫蛋白基因启动子(mMT)、肽链延伸因子启动子(EF)、热激蛋白启动子(HSP)、肌酸激酶启动子(MCK)和β一肌动蛋白启动子等细胞源的启动子一增强子元件。这类元件多数是常规表达量高的持家基因顺式调控原件，为真核细胞本身所固有。这类元件可单独使用，但更多是和病毒源启动子构建双启动子表达载体。

在双启动子表达载体中，启动子转录方向可以是同向的，也可以是反向的。在同向转录时，由于上游启动子转录会穿过下游启动子，这样就使得下游启动子的转录受到一定的影响，使下游转录水平下降。如果在两个启动子中间插入一个转录终止子，上游启动子对下游启动子的影响会减少，下游启动子的表达量会有明显提高。当两个启动子转录方向相反时，基因表达可能会被转录形成的反义RNA抑制。这时插入转录终止子将会消除这种不良作用。由RNA聚合酶Ⅱ转录出的RNA在3’端还有一个约100～200bp的poly(A)，该结构对维持成熟mRNA的稳定性有十分重要的作用。当表达载体缺少poly(A)序列时，外源基因的表达水平可能下降10倍以上。

由于外源基因转入真核细胞后的表达水平受多种因素影响，包括重组质粒拷贝数、转录效率、mRNA加工过程及其稳定性、翻译效率、蛋白质加工效率等。能够高效表达某一抗原基因的表达载体对另一抗原基因而言可能并不合适。因此，必须根据实际情况，选择合适的表达调控元件，构建合适的表达载体3。