[科普中国]-蜂蜜酵母

蜂蜜酵母的筛选

酵母菌分离纯化取自然发酵的蜂蜜发酵液1mL，梯度稀释至10-7。选择10^-3～10^-4稀释度，取稀释的50μL菌液涂布于麦芽汁培养基和沙氏培养基中，28℃培养48h，待长出菌落，挑选整齐的单个菌落，将单菌落划线分离2～3次，直至菌落形态和菌体形态基本一致，经显微镜检验为纯种后转于麦芽汁琼脂斜面，4℃保存。菌种用阿拉伯数字S1，S2，S3，S4…依次编号。

酵母菌的初筛取10mL糖度为10°Brix的麦芽汁液体培养基，灭菌，冷却后接种8%酵母菌，比较酵母菌在杜氏管中的产气情况，筛选产气量大，起酵时间在48h内的酵母菌株。记录发酵时间和产气情况，重复3次。活化条件：10°Brix麦芽汁液体培养基28℃震荡10h，接种量8%；发酵条件：13°Brix麦芽汁28℃静止发酵48h。

酵母菌的复筛高渗耐受性

采用杜氏发酵管法测定酵母菌耐高渗能力。将分离菌接种到40%乌桕蜜试管中，28℃培养24h。在660nm处测定OD值。试管连续培养，观察泡沫产生情况。根据气体产生的速度和产气量，比较不同酵母菌株的耐高渗能力。

酒精耐受性

从实际生产而言，要想采用直接发酵法生产出酒精度较高，品味良好的蜂蜜酒，一般要将酵母菌直接置于25%～30%的蜜汁中培养。酵母发酵能力在很大程度上取决于它对酒精耐受力的大小。采用30%蜂蜜、20%酒精环境下筛选酵母菌。取已灭菌的试管数支，以无菌操作将酵母菌接入体积分数为20%乙醇和无菌麦芽汁培养基中，摇匀，28℃培养7d，然后在660nm处测OD值，同时观察气泡产生的情况。

pH耐受性

耐酸酵母是指在pH≤4的环境下，可以生长或代谢的酵母。采用pH4.0的环境培育筛选酵母菌。将分离菌接种到pH4.0的麦芽汁液体培养基中，培养24h，在660nm处测OD值，观察气泡产生情况。

SO2耐受性

采用添加200mg/LNaHSO3的方法，比较OD值和产气时间。将酵母菌接入含200mg/LNaHSO3的麦芽汁培养基中，在相同条件下培养，于660nm处测OD值。同时观察杜氏管中的气泡产生情况（产气时间和产气量），筛选所需酿造菌株1。

蜂蜜酵母活性测定发酵性能的测定将蜜起始糖度调整为25%，75℃灭菌30min，冷到28℃左右，加入0.15%阿米诺酶，分别接入5种活化的优良菌种（S2、S11、S21、S33、S37）和0.2%葡萄酒活性干酵母（CK），28℃，发酵7d，测定蜂蜜酒的酒精度、残糖、酸度和总酯等理化指标。

酒精度的测定：密度瓶法；pH值的测定：采用pH计法；总糖的测定：手持测糖仪；酸度的测定：滴定中和法；总酯的测定：蒸馏皂化法。

酵母菌发酵力测试采用CO2失重法，将活化好的优选酵母菌液和CK菌液接入已灭菌的麦芽汁培养基中，接种完毕，称重发酵瓶，28℃培养，连续发酵12d，然后每天称重1次。称重前先摇晃瓶子，除去二氧化碳。以产生CO2的量（发酵瓶失重）为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制发酵速率曲线。

凝聚性测定将活化好的菌株和CK分别接种于麦芽汁液体培养基中，28℃培养5d。取培养液置离心管中，3500r/min离心15min，收集酵母细胞。用无菌水洗涤2～3次，取酵母泥1g，放入15mL离心管中，加入10mLpH4.5的醋酸缓冲溶液，摇匀，使其成悬浮状态，20℃水浴中静置20min。将此悬浮液连续摇动5min，让酵母重新悬浮，再静置，记录10min时沉淀酵母的容积，即酵母细胞沉淀的体积，本斯值。凝聚性强弱依据本斯值来确定。

蜂蜜酒酵母菌的分子生物学鉴定为进一步确定优良酵母的种属地位，从酵母菌初筛、复筛的实验结果中挑选1株代谢旺盛的供试酵母菌，用无菌水洗涤。用酵母基因组DNA试剂盒提取酵母的DNA。以扩增酵母菌26SrD-NA序列的通用引物设计PCR扩增引物，上游引物5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，下游引物5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’。

PCR反应体系25μL，其中10×PCRBuffer2.5μL，dNTP2.0μL，10μmol/L上、下游引物各0.5μL，酵母基因组DNA1.0μL，TagDNA聚合酶0.5μL，其余为ddH2O。反应条件：94℃变性3min；94℃变性50s，55℃复性50s，72℃延伸1.5min，共30个循环；72℃延伸10min。扩增产物与PGEMeasy-T载体连接，阳性克隆经酶切鉴定后测序。所得序列用Blast软件与GeneBank中的其它酵母菌26SrDNA序列进行比对，找出与其相似性最高的序列及酵母菌种类，用MEGA4.0软件采用邻近法（Neighbor-Jointing）进行系统进化树的构建与分析2。