[科普中国]-双元载体

早期的双元载体

1、复制起始位点

有许多载体上携带有一个广谱复制起始位点如pCB302、pBINZI含有pRKZ序列，pGreen

含有PS等，因此能够在所有的革兰氏阴性菌包括大肠杆菌和农杆菌中复制，但是它们的拷贝数很低，不利于遗传操作。而增加一个多拷贝数的复制起始位点可使这些载体产生更多的拷贝，利用pBR322的ColEI，pCB200O系列载体拥有非常高的拷贝数。除了psa，pGreen载体也利用Co1EI来获得高拷贝数。含有农杆菌复制起始位点pRi的pC22和pCGN1547在农杆菌中则只有一个拷贝1。

2、大肠杆菌筛选标记

常见的大肠杆菌筛选标记主要包括抗卡纳霉素(如pCB302、pBIN22、pGreen)、庆大霉素、四环素、大观霉素(如pBECKS2000)、链霉素(pBECKSZO00)等。

3、质粒的大小

常见的质粒通常大于10kb，如pCB2002大小为11kb，pBN19大小为12kb，pJJ1881大小为26kb，用于大片段转化的pYLTAC大小为22kb，使得多克隆位点的选择受到较大限制，基因操作不方便，且质粒载体在体内的重组效率和其大小成反比。随着人们对于转化DNA大片段的需要，要尽可能的减小载体的大小。将BPIN19载体上非T一DNA的部分去掉了约skb的片段，同时保留了双元载体的关键成分得到的pCB3OZ仅有3.skb，是文献报道的最小的双元载体。不同的复制起始位点大小有很大差别，因而通过采用小的复制起始位点可以减小载体的大小，如质粒pPZP上的pvsl(Sta和r即)比pRK和pRi小。

4.双元载体的T一DNA

T一DNA的边界序列来源于不同的Ti质粒，但是它们的序列相差不大。其他则采用的人工合成的T一DNA边界序列，如pBECKS2000。早期的双元载体通常是将筛选标记放在T一DNA的右边界，后来发现在T一DNA转移过程中右边界在前，因此，有可能在转化过程中被某种因素所阻断从而产生只含有筛选标记基因的假阳性转化体出现。通过T一DNA内部结构的改变形成了不同的载体系统，从而达到不同的目的，如用于复制起始位点启动子和增强子分析，激活突变库创制，插入导致的基因失活以及转座突变体库创制等，这些载体的T一DNA内部结构有着较大差别1。

CPB2002载体含有一个GUS基因序列，在其上游为一多克隆位点，可用于启动子的分析。根据拟南芥叶片和根的生物芯片的信息，将一些大量表达的基因上游启动子序列克隆到该载体中构建了一系列用于启动子分析的载体。在pCBZOO3的多克隆位点上游加入一个盐诱导表达启动子Sa了入可以研究在高盐存在的条件下目的基因的生物学功能。pGreen的多克隆位点含有18个限制性内切酶切位点，可根据不同的需要选择性插入所需要的筛选标记基因、报告基因等，为提高转化效率和减少假阳性转化体的出现，可以在T一DNA两端同时使用不同的植物筛选标记。pBIN19的衍生载体NP阳Kl在T一NDA的左右边界各含有一个植物筛选标记，与用一种筛选方法相比明显减少假阳性率，转入的基因可以得到更稳定的表达。

双元载体的研究进展(一)大片段DNA的转化载体

生物对外界胁迫的抵抗或自身代谢的调控都是由一系列的基因共同作用的结果，要研究这些基因的功能，就需要一种载体系统能将这些自然或者体外合成的基因串转化到植物基因组中以便于研究。许多对农业生产非常重要的基因已经被定位到具体的染色体上，但是对于大多数农作物而言都无法用T一DNA插入突变的方法得到饱和的突变体群来完成这些基因的定位，使用大的DNA片段进行基因互补转化能够有效地完成对这些目的基因的精确定位。基于基因图谱的克隆技术常被用来克隆新基因，目的基因与标记基因间相对位置的精确定位取决于对于突变体表型的精确衡量和后代数目的准确检测，每一个突变位点的精确定位通常需要1000个后代植株，如果目的片段位于一个低重组区域，该基因的定位将更加困难。

(二)多个基因的转化2

农杆菌介导的转基因对于单基因的研究非常常见，但是一些重要的生物学特征如抗逆性和一些复杂的代谢途径常常是多个基因共同作用的结果。我们可以通过：一、不同转基因植株的杂交;二、按照顺序依次转化；三、携带不同的基因片段的载体同时转化；四、将不同的外源基因在体外连接到同一个转基因载体上等方法实现多基因的转化。很明显前两种方法需时长，第三种方法结果的偶然性很强。第四种方法，需要找到一种方便快捷的外源基因连接方法。原理非常相似:都采用了Cre/loxP点特异性重组。

(三)植物筛选标记可除型载体