[科普中国]-固相酶联免疫吸附分析方法

简介

酶免疫测定是一项临床疾病诊断与实验室分析中常用的实验技术，可分为均相和非均相两个种类。按照是否需要固相载体作为吸附剂，非均相酶联免疫吸收分析又可分为液相和固相两类。其中，固相非均相酶免疫测定技术的应用最为广泛，这项技术是在1971年由瑞典的ENGVALL和荷兰的WEEMEN分别独立建立的，并被命名为酶联免疫吸附测定。

ELISA的原理基于抗原和相应抗体之间的特异性结合，在此基础上与酶促反应联合，利用带有酶标记的抗体或抗原对待测样品进行捕捉测定。标记酶可催化特定底物发生显色反应，进而利用比色法对检测样品进行定量或定性的分析。作为一项固相免疫测定技术，ELISA 技术的关键是通过吸附和固定的方式，将抗原或抗体固定在某一特定固相介质的表面，即固相化过程。固相化是进行 ELISA 操作的前提条件，为抗原与抗体的结合反应提供固体反应场所的同时，还可对待检样品进行有效分离，加之后续酶反应的生物放大效应的优点，显著提高了检测敏感性。通常认为，用抗原或抗体涂覆固相介质制备固相吸附剂这一环节，是决定 ELISA 分析检测体系敏感性的重要因素1。

固相化介质类型1967年CATT等发现，蛋白质可以自发地吸附在塑料平面上。这一发现使当时仅被作为反应容器的普通塑料试管的初始模型，变成了如今种类繁多的固相介质。此后，固相免疫学技术开始快速发展，并逐渐取代了由BERSON和YALOW所提出的放射性免疫测定法。20世纪70年代后，以ELISA为代表的固相免疫学技术的兴起，使不同形状与材质的固相载体被广泛应用，塑料试管的作用逐渐被聚苯乙烯微孔板、微珠及免疫磁珠等介质所替代。

按形状分类依据形状的不同，应用在ELISA中的固相载体可至少分为3类：小试管、小珠和微孔板。

1、小试管

小试管作为固相载体，其优点是拥有较大的吸附表面，且可根据实验设计的具体要求，灵活调节需加入的反应物体积。增加标本反应量有助于提高检测敏感性。另外，在结束显色反应后，可直接把小试管当作比色杯，放入分光光度计中进行比色操作。

2、小珠

在ELISA中，被用作固相载体的小珠一般为直径0.6 cm的圆球。此种小珠的表面经打磨后其吸附反应物的面积可有明显增加。此外，球型小珠的表面弧度利于减少空间阻力，便于抗原抗体结合，从而提高反应灵敏性。小珠的另一特点是易于漂洗，可减少非特异性结合。但由于在制作过程中打磨处理步骤难度大，重现性低，小珠类固相的均一性较差。

3、微孔板

微孔板是ELISA操作中最常用的固相载体，国际上标准的ELISA微孔板为96孔板。微孔板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并在酶标仪上迅速读出结果。

按材料分类可根据材料的不同对固相介质进行区分。ELISA可使用许多不同材质的固相，如硝酸纤维素（nitrocellulose, NC）、尼龙、聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride, PVDF）、聚苯乙烯、磁性材料等。

1、NC、尼龙、PVDF等

应用 NC、尼龙与PVDF等材料制作而成的微孔膜可作为固相载体参与免疫检测，如Western blot与ELISPOT。固相载体膜的特点在于其多孔性。其吸附面积是平板类固相的100~1000倍，这可能是因为微孔膜的表面孔多，并存在极大的内部环境供反应物结合的缘故。因此，固相载体膜很容易发生非特异性吸附。当应用膜载体作为固相介质时，往往需要配合封闭试剂的使用并保证对膜进行充足且广泛的洗涤，以去除非特异性吸附。3 种材料特性的比较，见图1。

2、聚苯乙烯

聚苯乙烯（polystyrene, PS）是一种高分子聚合物，聚苯乙烯的主链结构为碳链，侧链带有非极性基团苯环。以聚苯乙烯为原料生产的试管、微孔板和微球等载体，具有质地坚硬且耐碱、耐有机酸和无机酸腐蚀的特点，其价格低廉，高透明度与无毒性的优势，使聚苯乙烯材质被广泛应用于各实验室的 ELISA 检测中。但由于聚苯乙烯具有强疏水性，抗体或抗原在此固相表面的被动吸附主要是依靠疏水键的作用，在一定程度上限制了它的应用。

3、磁性材料

磁性材料可被用于制作免疫磁珠。免疫磁珠是应用 Fe、Co、Ni 等金属元素及氧化物等材质制作而成的纳米粒子，对其进行外部修饰后，可通过共价交联或物理吸附的方式结合反应物分子。

以免疫磁珠作为载体具有以下特点：①免疫磁珠比表面积大，能结合更多的蛋白分子，可提高检测范围。②免疫磁珠可均匀悬浮于反应溶液中，增加与样本中的待测物的反应接触面积，可减少反应时间。③在外加磁场的作用下，固液相的分离十分简单，可减少大量清洗步骤，也可达到富集目标样本物质的作用。上述 3 种固相介质的特征，见图2。

现阶段各实验室 ELISA 分析中最常使用的固相载体是聚苯乙烯材质的微孔板。从图2 可见，聚苯乙烯板的优势在于其制作价格低廉，并可对大样本进行检测。另一方面，目前已有多种自动化仪器可用于酶标板的 ELISA 检测，例如全自动洗板机、酶标仪等，上述仪器的应用对于 ELISA 操作的标准化极为有利。但随着临床诊断与实验室研究对 ELISA 技术要求的不断提高，聚苯乙烯微孔板的缺点也日益显著，主要表现在以下两个方面：①在使用聚苯乙烯微孔板对抗原或抗体进行固相化的操作过程中，反应物分子的生物学活性可能会受到影响甚至改变。SCHONE 等研究表明，抗原或抗体分子被固相界面吸附后，其分子构象的变化会发生改变，进而影响其生物学性质。通常情况下，生物大分子在亲水性固相表面，能较好地保持其原有的结构状态，并能保持其原有活性。而在由聚苯乙烯等强疏水性固相表面上，被吸附的分子需要通过疏水作用与固相介质相结合。因此，为了将其分子内部的某些疏水性核团暴露在表面，该分子会经历一个空间构象的去折叠过程，在此过程中可能会因构象的改变而影响其功能。②微孔板表面积一定，抗原抗体包被量有限，从而限制检测灵敏度和检测上限。因而改进微孔板的性能、改进抗原或抗体的固相化方法被认为是提高检测分析灵敏性、特异性和可靠性的最佳方案2。

抗体或抗原的固相化方法固相化，即通过吸附或固定的手段，将抗原或抗体等生物分子固定于固相介质表面。抗原抗体分子可通过物理吸附等非共价结合方式或化学共价结合的方式被固定于微孔板的表面，其中前者系简单的物理吸附固相化手段，是临床诊断和各实验室 ELISA 操作中最为常用的方法。

物理吸附物理吸附是指利用抗原或抗体与固相介质之间的疏水相互作用、静电力以及范德华力等物理因素的作用方式，使反应物吸附在固相介质的表面。在此过程中，生物分子附着在固相介质表面存在着较大的随意性，吸附于固相表面的生物分子的结构由于折叠或者功能性结合部位朝向固相而发生严重的改变，其中后者对于抗体包被的影响较大。另一方面，生物分子可能会在漂洗操作中，因剧烈的摇动而从固相表面脱落下来。

由于物理性吸附在固相化稳定性方面的效果不尽如人意，且待吸附的反应物与固相介质之间的相互作用，仅仅发生在介质表面的几个原子层，所以研究者常采用表面改性的固相化方法，改善聚苯乙烯微孔板对抗体或抗原蛋白的固相化能力，减少在洗涤操作中反应物脱落的现象，以提高检测体系的稳定性与可靠性。

表面改性是指在保持实验材料原有性能的前提下，对其进行表面处理、辐照等操作，从而赋予此种材料表面新的性能，如亲水性。根据方法与原理的不同，可将对微孔板的表面改性方法分为物理改性和化学改性两种。抗原-抗体间接吸附法以及利用高聚物对微孔板表面进行涂覆处理，是物理改性方法的代表；化学改性则采用化学接枝的方法，即在聚苯乙烯表面结构中引入-NH2、-COOH 等化学基团。

物理改性方法1、亲和素-生物素（生物素化抗体或抗原间接吸附法）

亲和素可与生物素发生非共价结合，两者之间的亲和力极强。生物素属小分子，分子质量约为244.31 u；亲和素分子量质量大，约为65000 u，易与聚苯乙烯微孔板表面结合。每个分子的亲和素由 4 个亚基组成，可同时与 4 个生物素分子结合。基于上述特点，研究者们将亲和素-生物素系统应用于抗原或抗体的固相化操作中。

利用链霉亲和素分子对固相载体进行预包被，同时将待包被抗体或抗原分子生物素化，随后可通过生物素-链霉亲和素结合反应将抗原或抗体分子吸附于固相载体上。此种间接固相化的方法具有放大效应，预包被在微孔板底部的亲和素，能以多价形式与生物素化的包被样品结合，从而提高检测反应的灵敏度。另一方面，亲和素-生物素复合物，其结合牢固且不可逆，显著增强了固相载体的稳定性。此方法在微阵列酶联免疫技术的操作中较为常见。微阵列酶联免疫技术是一种新型基于微孔板的蛋白芯片检测体系，该技术与传统 ELISA 相比，可对单个样本的多种指标进行同时检测，且样本用量少，易满足临床检测的需求。

此外，亲和素-生物素系统可用来解决某些疏水性抗原的包被难题。KETELSEN 等的研究发现，疏水性抗原可与生物素化的脂质结合，进而将其固定在预包被了亲和素分子的微孔板上。

2、重组蛋白质 A、G 和 L

抗体分子在吸附于固相表面后，可存在功能性结合部位朝向固相介质的情况，从而严重影响抗体分子的活性。通常认为，抗体的 Fc 端朝向介质一面，会促进具有识别抗原表位功能的 Fab 端充分暴露，也是抗体固相化的最理想的空间取向。SEO 等根据重组蛋白质 A、G、L 能与抗体的 Fc 端发生稳定结合的特性，将上述蛋白在固相载体进行预包被，而后再进行相应抗体的包被处理，从而保证抗体的生物学活性不会受到空间取向等因素的影响，显著提高了抗体的固定效果。

3、涂覆处理

PVDF 膜、尼龙膜为代表的膜型固相介质相较于微孔板来说，其可供给抗原或抗体等反应物吸附的面积大而广泛，能明显增加反应物包被的数量，从而提高检测灵敏度。BARABAS等提出，将具有更强吸附能力的 PVDF 膜或尼龙膜等，经过处理预先包被或溶解于微孔板表面的想法，旨在进一步提高微孔板的吸附能力。HALIM 等基于上述原理，创立了 PVDF-based ELISA，并用于检测肌动蛋白，实验结果显示此种方法的检测下限能够达到 pg 级别。

化学改性方法微孔板经化学表面改性操作后，抗原或抗体可通过共价结合的方式与板上的某些化学基团紧密相连。相比于简单的物理吸附与非共价结合作用，这种固定方法固定强度更高，可重复性更强，有助于提高检测的敏感性和特异性。

1、小分子多肽的固相化

小分子多肽被广泛应用于检测某些生物样品的特异性抗体，但因其分子结构中疏水性区域少，无法凭借疏水性作用途径将其固定于微孔板上。目前实验室常采用合成肽与载体蛋白共价偶联后共同包被的方法，但其操作时间较长且制备重复性差，且还有可能降低合成肽段的免疫原性，以至于降低 ELISA 的检测效果。CUCCURU 等提出一项简便而又快捷的方法，先将用马来酰亚胺进行过活化处理的牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）或钥孔虫戚血兰素（keyhole limpet hemocyanin, KLH）涂覆于微孔板表面，过夜孵育后，再加入溶解在马来酰亚胺偶联缓冲液中的小分子肽段。此方法使肽段与涂覆层之间发生直接交联反应，避免了纯化合成肽与载体蛋白复合物这一耗费时间的步骤，提高了检测效率。

2、紫外线照射处理

PALACIOS 等通过实验证实，用适当强度的紫外线处理聚苯乙烯微孔板，可提高微孔板的包被效果。其机制尚不清楚，可能与聚苯乙烯微孔板经紫外线处理后，微孔板表面形成了羧基，从而增强了微孔板亲水性有关。

3、FNAB 活化处理

NAHAR 等用4-叠氮基-1-氟-2-硝基苯（1-fluoro-2-nitro-4-azidobenzene, FNAB）对聚苯乙烯微孔板进行了活化处理，FNAB 的叠氮基团在紫外照射下可与聚苯乙烯分子中的苯环发生结合反应，FNAB分子上的氟取代基可与抗原之间通过共价键进行结合，从而将抗原固定在微孔板表面。此方法显著提升了微孔板对于蛋白质的固相化效果。

4、高碘酸钠处理

SUZUKI等用高碘酸钠处理聚苯乙烯微孔板，其原理与FNAB活化处理法类似。处理后的微孔板表面接枝生成醛基仔硼烷，其可以与蛋白质中的氨基基团发生共价结合，以此将蛋白质固定在微孔板表面。此方法可大幅提高反应物的包被量。

5、羧甲基葡聚糖层接枝

羧甲基葡聚糖（carboxymethylated dextran, CMD）是酵母葡聚糖的羧甲基化衍生物，这种无污染的材料被 LIBERELLE等研究人员加以利用。在 N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide, NHS) 和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（N-Ethyl-N′-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, EDC）偶联剂存在的条件下，将CMD涂层覆盖在微孔板表面，使待包被抗体通过自身的游离氨基与CMD分子中的亚胺基共价结合，间接固定在介质表面。此方法可将抗体包被时间从过夜孵育缩短至15 min，有效提高了ELISA检测效率3。