[科普中国]-载体结合法

简介

将微生物结合到载体上进行同定化的报道很少，仅报道过将微生物吸附到离子交换型非水溶性载体上的例子。例如，有人报道，将大肠杆菌和灵敏固氮菌的活细胞结合到离子交换树脂Dowex I(C1型)上，可以得到对葡萄糖、琥珀酸等具有氧化能力的固定化微生物。又如可把米曲霉孢子结合固定在CM一纤维素、磷酸纤维素、DEAE一纤维素和ECTE—OLA等纤维素上，并测定了它们对转化酶的活性。但是，用此法固定化的微生物，在使用中由于菌体本身会发生自溶，有时会漏出酶蛋白，因而并不是一个十分理想的方法。

载体结合法分类此法使酶与不溶性载体结合，形成不溶酶。根据结合时化学键的不同，又可分为如下两类：

共价键法使酶蛋白通过共价键与不溶性载体结合。酶蛋白分子中，参与形成共价键的基团有：氨基酸的游离氨基、游离羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基等。常用的载体有纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂及淀粉等的衍生物，以及甲基丙烯酸聚合物、顺丁烯二酸酐和乙烯的共聚物、氨基酸聚合物等人工合成的聚合物。

共价键法操作比较复杂，反应条件不易控制，但结合牢固。目前，国外这方面研究最活跃，报导最多。又分为以下三种方法：

1)重氮法：具有氨基的不溶性载体，用亚硝酸处理，使成重氮盐衍生物，再和蛋白质中的游离氨基，组氨酸的咪唑基和酪氨酸的酚基等发生偶联反应，生成不溶酶。如图1

常用的载体有，对一氨基苄基纤维素、3一(对氨基苯氧基)-2一羟基丙醚纤维素、间一氨基苯胺基纤维素、氨基苯甲基甲氧纤维素等。例如，糜蛋白酶、L—谷氨酸脱氢酶、过氧化氢酶，可用此法与对一氨基苄基纤维素形成不溶酶。

2)肽键法：此法借肽键使酶蛋白与不溶性载体结合。又可分为以下两种方法：

a．迭氮法：将羧甲基纤维素等经处理后，生成迭氮化物。在低温下，再与酶分子中游离氨基、羟基、巯基发生反应，形成不溶酶。如图2

例如，淀粉酶、糖化淀粉酶、胰蛋白酶，可用此法与羧甲基纤维素迭氮物形成不溶酶。

b．卤化氰法：纤维素及葡萄糖凝胶等经溴化氰活化后，在偏碱性条件下，与酶偶联，形成不溶酶。

3)烷化法：以卤素为功能基的不溶性载体，与酶蛋白分子中赖氨酸的ε一氨基、N一末端的α一氨基、酪氨酸的酚基或半胱氨酸的巯基发生烷化反应，形成不溶性酶。

常用的载体是纤维素、葡聚糖凝胶及琼脂等的衍生物。例如，糖化淀粉酶、核糖核酸酶和胰蛋白酶，利用此法，可和氯一S一三嗪基纤维素形成不溶酶。

2)离子键法：含有离子交换基团的不溶性载体，可与酶蛋白分子形成离子键，而得到不溶酶。此法操作简便，处理条件缓和，酶蛋白的活性中心和高级结构破坏较少，可以得到活力较高的不溶酶。缺点是离子键结合较松散，如在高离子强度下进行反应，酶和载体很容易分开。常用的载体有含有离子交换基团的纤维素和葡聚糖凝胶等。例如，蛋白酶、蔗糖酶、天门冬酰胺酶等可用此法和二乙基氨基乙基纤维素(DEAE一纤维素)形成不溶酶1。

表面吸附法表面吸附法是微生物细胞与载体之间通过静电引力将微生物细胞固定的方法(图3)。很多类型的微生物细胞有吸附在固体物质表面的天然倾向。由此，常常会造成一些麻烦，如海船底部粘满了海藻，牙齿表面形成牙菌斑等。但是，也可以利用微生物细胞固有的吸附能力用于制备固定化细胞。供吸附细胞用的载体都是多孔性物质，包括高岭土、硅藻土、多孔硅、聚氯乙烯碎片、活性炭、木屑、离子交换树脂、多孔玻璃等。

这种方法早在1820年就用于酒精生产“速酿酸”(即“醋”)。曾有人用此法生产啤酒、酒精，也应用于污水处理等方面。也有作者用此法固定哺乳动物细胞，生产生化药物。该法容易受周围环境影响，但简便易行2。