[科普中国]-反相固相萃取

固相萃取

固相萃取是利用选择性吸附与选择性洗脱的液相萃取分离原理，即生物样品通过含有吸附剂的固定相，保留其中某一组分，再选用适当的溶剂洗去杂质，然后用少量洗脱液迅速洗脱，从而达到分离、净化与浓缩的目的。这要求待测物质与固定相之间的作用力要大于待测物质与基质之间的作用力。待测分子与固定相之间的作用力包括：偶极、静电引力、氢键、离子键、范德华力等，有时也利用尺寸排阻。即使SPE具有较高的选择性，也不能完全去除杂质的干扰，因此后来又出现固相微萃取(SPME)、分子印记聚合物、盘状SPE(SPEC)及复合模式的SPE等。新近发展的固相萃取不但提高了选择性，而且加大了流速，缩短了分析时间，易于自动化。

反相固相萃取反相固相萃取是使用非极性的固定相，在样品或吸附剂上增加离子对试剂，有助于用反相萃取分离强极性物质。在R-P的SPE中，有机分子吸附剂是通过-si-o-si-c键合到硅氧烷胶体上1个氧原子与si键合叫做monfunction，3个氧原子与si键合叫做trifunction，后者对酸性物质有较强的耐受力。目前用得最广泛的键合固定相有C18[octadecasi/y/ODS(CH2)17CH3]、C8[octy/(CH2)7CH3]吸附剂，另外还有环己烷基、丙基、乙基、甲基、苯基1。由于硅胶衍生不完全，有-OH暴露在硅胶表面，当pH> 2.0时，硅胶表面的-OH与样品中其他离子作用会干扰待测物的吸附。后来有人用硅烷基取代硅胶表面的-OH，叫做end-capp-ing。这样就有效地避免了由-OH带来的干扰。近来又有人合成了疏水的N-vinylprrolidone和亲脂的二乙烯氮苯混合吸附剂，提供了疏水和亲脂的平衡，这种吸附剂不需要预处理，而且即使吸附剂干燥也不影响萃取效果，这种材料在制药业已得到广泛使用。

反相固相萃取在兽药检测中应用填料硅胶表面的亲水硅醇基通过硅烷化学反应，键合非极性烷基或芳香基、聚合物等材料作为反相固定相，被测物的碳氢键与固定相表面官能团产生非极性的范德华力或色散力，使得极性溶剂中的非极性以及弱极性的物质保留在固定相上，达到净化、富集样品的目的。大多数兽药属于极性或弱极性的化合物，对于强极性药物可以通过加入离子对试剂的方法，使目标物成为稳定离子对用于反相萃取，弱极性药物可以通过调节pH、改变溶剂组成的方法使药物残留处在分子状态，减小其极性低在反相中保留。反相萃取中洗脱液常用甲醇、异丙醇、乙酸乙酯、正已烷等有机溶剂，试验时可根据实际情况进行选择。Leitner A等采用聚苯乙烯填料固相萃取柱Li Chrolut EN净化动物组织中四种硝基呋喃类代谢物，用洗脱强度为0.45乙酸乙酯洗脱分析物，该净化方法回收率在92%～ 105%之间，4种代谢物的测定低限0.5 ng/g～ 5 ng/g，中性环境中的硝基呋喃类代谢物净化常用反相固相萃取法。Heller D N等测定鸡蛋中16种磺胺类药物，C18固相萃取净化，乙腈洗脱残留药物，样品的测定低限为5 ng/g～ 10 ng/g，通过对比氨基柱和C18柱，氨基柱回收率60%以下。Hirsch R等用C18柱测定水中18种抗生素，被测物回收率60%～ 91%，但是此净化方法不能用于测定四环素类抗生素，因为四环素在EDTA水溶液中产生不可逆吸收2。

固相萃取方法的选择固相萃取技术的分离模式有多种，具体使用哪种方法，主要取决于待处理样品的相对分子质量(Mr)及样品的性质。

1.选择固相萃取应考虑的问题：(1)待测物的化学性质：功能基团、能否离子化，是水溶性还是脂溶性。(2)基质的性质：pH值、离子强度、是水还是有机溶剂。(3)类似干扰物的性质。(4)待测物在样品中的浓度。(5)分析的检测限及灵敏度。(6)待测物是否需要富集、纯化。2.固定相的选择(根据相似相溶原则来选择固定相)：SPE的固定相是样品分离、纯化的关键，由于固定相关系到SPE的重复性、回收率、灵敏度、特异性，因此SPE的吸附剂一直是人们关注的热点。自SPE发明以来，聚合树脂的样品污染一直令人苦恼，1978年Waters公司发明了C18键合硅胶制成一次性小柱(Sep-pakR)，具有很高的可靠性和稳定性，已广泛应用于临床生化检验。凡可用于HPLC的吸附剂均可用于SPE，包括近年来针对药物滥用检测的“designerphase”。吸附剂的选择既要考虑样品各组分与固定相的亲和力、待测物与洗脱剂的作用力，还要考虑其通用性。就目前化学键合相而言，非极性键合相有C1、C2、C4、C6、C8、环己烷基、苯基、二苯基、C18等；极性和弱离子交换相有：氰基、二醇基、氨基、伯胺/仲胺基、丁酸基；强离子交换相有：丙磺酸基、苯磺酸基、季铵基等；吸附树脂有：XAD-2、GDX、X-5。具有选择专属性的苯基磺酸可用于分离共平面连位羟基结构分子。对于生物样品，大多溶解在水性物质里，待测物被离子化，用离子交换萃取分离极性很强的物质，非极性或弱极性分析物用R-P提取，正相萃取用于提取有机溶剂中的极性物质。吸附剂的用量必须保证从样品中有效吸附所有的待测物，不保留基质成分，增加吸附剂的量可增大吸附能力，但同时也增大洗脱体积，使待测物稀释，给干燥和定量带来困难。因此在达到有效吸附的前提下用最小量的吸附剂。