[科普中国]-金属间联合毒性效应

联合毒性研究的意义

随着工农业生产的迅猛发展，每年都有大量的有毒有害物质（如农药、工业污染物等）流入环境，其中大多数都是有机污染物或重金属，它们同时或先后进入环境，通过各种物理运输途径直接或间接进入水体，并在水体中共存，对水环境构成了严重的污染。所以有机污染物和重金属对水环境的影响备受关注。长期以来的毒理学研究多数基于单一物质，因为单一物质的毒性研究易于操作，耗资小，而且实验方法和原理相对简单。所以大量的单一有机污染物或重金属的物理化学性质和环境毒性效应被揭示出来，但是在实际环境中通常有多种污染物共存，我们不能只用化学品的单一毒性效应去评价其对环境的影响，因为在有两种或多种化学物质同时作用于生物的情况下，有可能会引起与各物质单独作用时不同的毒性反应，它们彼此影响，产生拮抗、相加或协同作用。

因此对两种或多种化学品的联合毒性效应研究更具实际意义，可以为环境标准的制定和生态风险评价提供更可靠的依据。

人们意识到混合物的联合污染问题可以追溯到上世纪70年代末。研究发现，原本单一毒性较小的化合物，在混合物中，有可能会表现出较高的毒性，因此以单一毒性制定的水质标准受到质疑，环境工作者开展了多方面的联合毒性研究，并以不同的划分方法对混合物的联合毒性进行评价。

重金属联合作用机理研究者发现：毒物对生物的毒性一方面取决于受试生物的敏感性，另一方面也取决于该毒物的浓度及其生物可利用性；金属化合物的阴离子不同，其生物可利用性有差异，导致相同的重金属离子对同一受试生物的毒性也可能有差异。铜和锌是生物生长所必需的微量元素，一方面它可以与生物体内一系列重要的酶结合，同时也可与一些结构蛋白结合，但是当它们的浓度过高，生物体原始的稳态即受到威胁，铜可对诸如DNA和蛋白质等生物大分子的结构和功能产生不利影响，当二者同时作用于机体时，

二者都可以与生物酶或金属硫蛋白结合，此时可能有两种情况发生：一是二者作用于不同的酶或蛋白，使生物体受到的损伤加大，即产生协同作用或相加作用；另外就是二者竞争相同的活性位点，使对方的可结合性降低，从而减小毒性，即产生拮抗作用。其它金属多数都是非生物体所需的，它们的联合毒性类型与铜和锌相似。具体的联合作用效应因生物受体不同、金属类型不同而有差异，需要通过实际毒性实验来判断。

由于联合毒性在国际上尚未形成统一的评价标准，因此，不同的环境工作者常选用不同的生物受体作为受试生物，进行联合毒性研究。发光菌是目前使用较多的一种生物标志物，这主要是因为该法具有快速、简便、灵敏、廉价和应用广泛等特点，但是发光菌也有细胞发光强度本底差异大，实验再现性差等缺陷。所以林志芬等改进了发光菌生物毒性测试方法，引入了校正因子，结果表明改进后的方法实验重现性好。斑马鱼也是应用较广的受试生物，它是国际标准实验用鱼，对化合物的毒性较敏感，技术成本低、易操作、灵敏度高，特别是具有可记录多项毒性指标的特点，可以此判断污染物的致毒机理1。鱼急性毒性实验一直是毒理学实验中传统的方法，利用各种成鱼进行的化合物联合毒性的研究也很多，但是由于经济鱼种较多，各地又有很大差异，所以采用的实验鱼多种多样，得到的结论也有一定差异，其中鲫鱼和鲤鱼是使用最频繁的，根据鱼96h-LC50而计算的化合物安全浓度对实际水环境保护具有很强的指导意义。

联合毒性作用机制与影响因素联合毒性是一类综合性的生态学效应，在作用机制上包括协同、拮抗、竞争、保护、加和、抑制、独立作用以及其他交互作用[23]。影响化合物联合毒性作用的因素较多：环境介质的种类和pH值、受试物浓度和浓度配比、染毒时间长短、受试组分间接触程度和加入的先后顺序、指示生物的类别及其年龄、性别、大小等，在水体中还要考虑盐度、温度和硬度等。

联合毒性作用机制联合毒性作用机理研究是进行化合物联合毒性作用研究的重点和难点，经过环境工作者多年的研究，主要有以下几种作用机理：

（l）影响生物细胞结构

两种或多种化合物通过影响生物的细胞结构，特别是膜结构而发生相互作用。膜结构是污染物相互作用的优先部位，它的改变使膜的通透性发生变化，从而影响物质向生物体内的运输。Stewart等发现Cu可改变原生质膜中可溶性部分的渗滤性，从而造成细胞膜的损伤，使得膜体变得很脆弱，重金属更易进入。对细胞器结构功能的改变也会影响复合污染物对生物体的毒性。杨志敏等认为Ca2+是通过使细胞膜表面致密，或在细胞膜表面形成保护膜的方式，抑制Zn2+的毒性，即对Zn2+产生解毒作用。湛灵芝研究了Cr6+和乙草胺对少根紫萍的96h联合毒性作用，发现它们对少根紫萍产生协同作用是由于它们均能破坏少根紫萍的细胞膜结构与功能，由于其中一种污染物对细胞膜的作用，使得另一种污染物更容易进入植物体内，加剧了对植物细胞的伤害，从而表现出协同作用。Moreau等认为菲对Zn在生物体内蓄积的拮抗作用可能是因为菲改变了溶酶体膜的稳定性及功能，从而影响了溶酶体解除Zn毒害的作用。

（2）竞争活性部位

根据“受体”学说，化学物质在生物体内都有特异性的活性反应靶位。物理化学性质相近的污染物在细胞表面及代谢系统的活性部位存在着竞争作用，从而影响污染物的相互作用。对吸附位点的竞争会导致一种污染物从结合位点上取代另一种处于竞争弱势的污染物，这种竞争的结果在很大程度上取决于参与竞争的各污染物的种类、浓度比和各自的吸附特性。致毒的污染物浓度比并不就是污染物总浓度的比值，在土壤化学水平上金属离子竞争性吸附的相互作用，导致了金属在固相和水相间的分配，这一过程也改变了金属离子的生物可利用性，使其生物可利用性与联合毒性紧密相连。

重金属在生物体吸收和生物体靶位点上也存在着相互作用，当两种或多种金属同时暴露在土壤中时，重金属竞争结合位，从而改变了实际可生物利用的重金属浓度，由此会以一种与暴露于单一金属完全不同的方式影响微生物。Stewart等研究发现，Cu、Zn、Pb、Ni等会与Cd一起竞争植物表面的吸收位点，从而影响植物组织对Cd的吸收。刘清等发现锌和锡等毒性混合共同作用于青海弧菌（Q67菌株）时，锡的浓度大，可以占据细胞表面的结合位，降低了锌的结合机会，从而毒性降低，显示出拮抗效应。这种竞争的结果很大程度上取决于参与竞争的各污染物的种类、浓度比和各自的吸附特性。

（3）影响酶的活性

污染物联合作用会影响与污染物代谢有关的酶的活性，改变污染物在生物体内的代谢速度和转化情况等，从而增加或降低污染物的毒性，产生不同的联合毒性作用。有些化合物可以抑制生物体内自由基的产生，从而降低过氧化胁迫，使其他共存的毒物的毒性降低。孙金秀[31]等认为有机磷增加了拟除虫菊酯的水解酶而出现毒性增加的结果。Posthuma等[32]将金属结合蛋白被特定金属激活后表现出的作用视作金属间的复合作用，缺少这些金属会增加其它某些金属的毒性。

Morley等以夏口吸虫(Diplostomumspathaceum)作指示生物研究锌-锡的联合作用，由于参与糖元利用的酶的活性被抑制，导致有限的糖元储存利用率的降低，从而摇尾幼虫的存活率上升。

（4）络合或螯合作用

螯合(或络合)作用可改变污染物的形态分布和其生物有效性，从而直接影响其毒性。自然环境中存在许多络合剂，如腐殖酸、胡敏酸、氨基酸及某些功能团，如－OH，－NH2，－COOH，－SH等，它们能与污染物在环境中发生物理化学反应，改变污染物的形态、溶解度和生物可利用性等，从而影响了污染物之间的相互作用。一些金属螯合剂可与金属毒物发生螯合作用，形成生物体不能吸收、蓄积的螯合物形式，而使金属失去毒性。Sharma等发现植物根部螯合剂的生成使得Cu/Cd、Zn/Cd等复合污染表现为加和或拮抗作用。有机螯合剂和被螯合物可形成生物体几乎不能吸收、蓄积的螯合物形式，这一点是减毒的重要机制。Wang等发现硒对汞毒性的保护作用源于它们形成Hg－Se络合物竞争结合位的结果，因为汞对细胞有毒性，硒和Hg-Se络合物对细胞没有毒性，而硒酸钠和氯化汞又具有相同的结合位，所以当细胞同时暴露于硒和汞时，有些键位就被硒和Hg-Se络合物所占有，从而抑制了汞的毒性。

（5）干扰生物正常的生理过程

化合物的联合作用会干扰生物体正常生理活动，影响生物体对特定化合物的转移、转化、代谢等生理过程。研究者发现：生物可利用性是影响毒物对生物毒性的重要因素，而金属化合物的阴离子不同，其生物可利用性也有差异。因此，不同阴离子与金属离子的联合作用结果不同2。Kargin等认为Zn抑制Cd在鱼体中蓄积的机理在于前者可以抑制鳃对Cd的吸收，而这一点是通过加速已摄入的Cd向体内器官转移来实现的。

（6）对生物大分子的干扰

污染物可通过抑制生物大分子的合成与代谢，干扰基因的扩散和正常表达，对DNA造成损伤或使之断裂并影响其修复。联合作用可使这种干扰增加或减小，从而产生协同或拮抗的联合效应。唐学玺等人通过多环芳烃对海洋细菌的毒性研究，发现多环芳烃化合物的毒性作用就是破坏细胞的DNA，引起畸变、死亡。

Ling等[38]发现，Pb、Cd和Zn对小麦的DNA结构的损伤并不明显，但在DNA转录水平上显现异常。这表明Pb、Cd和Zn对基因表达的干扰作用远大于对其结构的破坏作用，这也可能是重金属致毒的重要机理。

影响联合毒性作用的因素（1）受试组分的浓度、浓度配比、加入时间和顺序的影响

混和物各组分加入的先后顺序不同，联合作用也不同。wang等在研究硒和汞对鳞鳅（stenellaplagiodon）的肾细胞的联合毒性时发现，如果先加入汞，那么硒就无法抑制汞对鳞鳅的肾细胞的毒性，而如果先加入硒，那么它就能够降低汞对鳞鳅的肾细胞的伤害。只有硒与汞同时加入，两者的拮抗作用才可见，而且硒的浓度越高、加入的时间间隔越短拮抗作用越强。合作用的类型和强度与各组分的加入顺序和比例有关，Virk等以鱼体蛋白质含量为指标，将同时加入Ni和Cd与先加Ni再加Cd的情况进行比较，发现前者毒性更大，协同作用更强；Thomulka和Lange研究了硝基苯与二硝基苯和硝基苯与三硝基苯以不同毒性单位比配比下的联合毒性，发现虽然联合作用以相加为主，但配比不同，联合作用强度还是有一定区别的，因而认为混合物组成及各组分的比例是影响混合物毒性的重要因素。

（2）指示生物

指示生物不同联合作用的类型也会有所不同。由于不同的生物其细胞结构不同，它们暴露于污染物时所发生的反应也会不一样，从而对污染物的耐受能力也有差别。Morley等发现用摇尾幼虫（Diplostomumspathaceum）作指示生物时，锡与锌发生拮抗效应；而当指示生物为老鼠筋属动物副睾（Patorchisacanthus）时，锡、锌高浓度等金属浓度混合则表现出协同效应。Vanegas发现锌－镉混合物对刚毛对虾（Penaoussetiferus）产生协同作用，而它们对双壳类胚胎却产生拮抗作用。

（3）测试终点

应该尽量选择敏感的测试中点。Kohler等建议使用亚致死终点如：分子水平的、细胞水平的生物指标或者生物生理指标，而不是致死率。因为它们更为敏感，而且在现场实验中种群准确的致死浓度和剂量是很难准确得到的。Femandez等[41]以海胆胚胎（Paracentrotuslividus）作指示生物，测定胚胎基因的连续性和幼体的生长率，发现幼体的最低可见效应浓度只及汞、铜、铅的半数抑制浓度的1/3，比锡的半数抑制浓度低两个数量级。如果仅以致死浓度来评价这些金属的毒性效应必然会低估它们的毒性。Phlips等发现分别使用叶绿素a含量法和细胞计数法测得的EC50值不同，最大的相差有四倍之多：以叶绿素a含量为指标的杀草快对隐藻7天的EC50值为19μg/L，而以细胞计数为指标的EC50值为7519μg/L。

（4）pH值

pH值是影响水体中重金属迁移转化的重要的理化因子，它们对Zn、Fe、Mn、Cu这一类重金属的迁移转化起着决定作用。在酸性条件下，Fe和Mn以容易溶解的Fe2+和Mn2+的化合物存在；而在碱性或近中性和氧化的条件下，则形成不溶性Fe3+和Mn4+的氧化物和氢氧化物。所以在酸性条件下，重金属的毒性较大，碱性条件下时，重金属的毒性降低。因此pH值对重金属联合作用的影响不容忽视。pH值对有机物的毒性也有影响。于瑞莲[43]研究了不同pH值下有机酸碱对发光菌的急性毒性，结果表明,胺类化合物对发光菌的毒性随pH的升高而增大；酚类和苯甲酸类的毒性随pH的升高而减小，这与不同pH下有机酸碱的电离程度和存在形式有关。

（5）染毒时间

随着染毒时间的延长联合作用的类型可能会随之发生变化。修瑞勤等[44]研究了氟硒共存对斑马鱼的联合毒性，结果表明在氟硒浓度1:1情况下短效应试验，24h为拮抗作用，48h为相加作用，96h为协同作用，鱼类长效应快速测定结果也表现为协同作用。侯丽萍等[45]发现锡与锌按毒性1:1配比，对草鱼种的联合毒性24h、48h均为拮抗作用，但这种作用随时间延长而减弱，在96h表现为协同作用。即随着染毒时间的延长，联合作用的类型和程度都可能发生变化。