[科普中国]-生物保藏

简介

病原微生物也是一种重要的生物资源，它的保藏 不仅有利于重现已经做过的实验，证实发现新的菌 ( 毒) 种，而且也是研究、推广、开发和实际应用科研成 果的基础。保藏的菌( 毒) 种有的是开发利用的对象， 有的是悉心研究的成果，有从自然界分离得到的，有经 生物技术修饰改造获得的，都有着极大的研究价值和 开发利用的潜力。因此，菌( 毒) 种的保藏工作至关 重要。

病原菌保藏1 病原菌保藏及其管理进展 为探讨一种能长期保存菌种的理想方法，以便更 好地为科研、教学提供标准菌株。有人将需保存的菌 株纯化后，用鲜牛奶制成常用菌悬液、高浓菌悬液，分 别分装菌种管中置 －70 ℃超低温快速预冻过夜，冷冻 干燥机真空干燥封口，－ 30 ℃保存，他们发现浓度为 106 ～107 个/ml 和510 ～1010个/ml 的菌液经15 年保存 后菌株的存活率分别为92． 3%和100%，经20 年保存 后菌株的存活率分别为61． 53%， 98． 46%。他们认为 鲜牛奶高浓菌悬液冷冻真空干燥可长期保存各种微生 物菌种[3]。也有人采用 8 种不同的菌种保藏方法，对 18 种常见病原菌的保藏时间及生物学特性的影响进 行了对比观察。结果表明，冷冻干燥法保藏菌种时间 最长( 该实验室已保存 15 年) ，肉浸液琼脂平板法保 藏菌种时间最短( 2 ～ 3 月) 。保藏时间由长到短依次 为冷冻干燥法 >半固体冷藏法≥半固体斜面加液体石 蜡覆盖法 >半固体斜面法 >肉浸液加液体石蜡覆盖法 >血琼脂平板法 >肉浸液法 > 肉浸液琼脂平板法，而 且相同方法对不同菌种保藏时间不同。保藏时间在 1 年以内的菌种，其生物学特性无明显变异，而经冷冻干 燥法保藏时间较长的白喉棒状杆菌、金黄色葡萄球菌、 甲型及乙型副伤寒沙门氏菌的生物学特性有不同程度 改变[4]。为探讨医学微生物实验室常用菌( 毒) 种的 保存方法和安全管理措施，又有人根据细菌的特性及 营养要求，选择适宜的培养基和培养方法，经生物学鉴 定合格的菌种，根据需要选择适当的方法保存，并指定专人负责保管和制定菌( 毒) 种安全管理制度。运行过 程他们发现，不同方法保存的菌( 毒) 种，保存时间不 一样。他们认为，实验室可根据实际需要选择最佳的 保存法，指定专人保管菌( 毒) 种并制定安全管理制 度，保证菌( 毒) 种质量和安全[5]。微生物菌( 毒) 种是 国家重要的生物资源和战略资源，与生物安全、人类健 康、环境保护和可再生能源等密切相关。医学病原微 生物是微生物学的重要组成部分，是能够引起人类各 种疾病的致病性微生物。在实验室生物安全日益得到 广泛关注的形势下，病原微生物菌( 毒) 种作为实验室 生物安全管理工作的核心内容，做好保藏管理尤为重 要。研究者根据新形势下我国实验室生物安全管理工 作的需要，综述了菌( 毒) 种保藏管理有关规范及要 求[6]。这也是我国 2003 年非典防控以来微生物实验 室生物安全重要举措的理论基础。

消化道病原菌2 消化道病原菌保藏进展 有人为了探索一种简便、实用并能长期保存小肠 结肠炎耶尔森菌菌种的方法，他们于1988 年将小肠结 肠炎耶尔森菌菌种( 血清 O:3 型和血清 O: 9 型) 接种 于鸡蛋斜面培养基及半固体培养基复苏后加灭菌液体 石蜡，置 －4 ℃普通冰箱保存，且每年进行复苏鉴定。 结果 O:3 型菌种可保存 21 年， O:9 型保存 22 年以上 依然存活。他们的体会是鸡蛋斜面保存法和半固体穿 刺法 －4 ℃保存小肠结肠炎耶尔森菌菌种效果良好， 可长时间保存，且不需要反复传代[7]。又有人[8]为探 索一种简便、有效的弯曲菌菌种保存方法。他们采用 含30%甘油的脑心浸液肉汤，将实验室保存的19 株 弯曲菌于 －30 ℃和 －70 ℃分别保存，每个菌株3 个菌 种管， 1 年后采用 5% 脱纤维羊血的布氏肉汤进行增菌，然后转种哥伦比亚血平扳，比较存活效果。结果显 示，－30 ℃条件下采用多管法保存弯曲菌可以获得与 －70 ℃条件下保存相当的效果。这些研究者认为采 用多管法( 每株菌3 个菌种管) 于 － 30 ℃冷冻保存弯 曲茵是一个简单、方便、有效、实用的方法。针对能够 较长时间地保存志贺菌的培养基鲜有报道，有人研究 出了一种在斜面上能够较长时间保存沙门氏菌和志贺 氏菌等肠杆菌科细菌的培养基[9]。有人对增菌培养基开展研究，他们设计出一种能同时富集培养沙门氏 菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的缓冲盐水肉汤 ( buffed salinebroth， BSB) ，主要组分和含量为蛋白胨 10 g、牛肉膏3 g、磷酸氢二钠9 g、磷酸二氢钾1． 5 g、添 加剂50 g，蒸馏水定容至 1 000ml， pH7． 2，将 1 cfu/ml 的上述 3 种菌同时分别接种到97 ml BSB、蛋白缓冲 水、乳糖肉汤、营养肉汤、大肠杆菌肉汤、氯化镁孔雀绿 增菌液、 7． 5% 氯化钠肉汤增菌培养基中， 37 ℃ 增菌 18h。结果表明， BSB 能使这3 种菌以相对一致的速度 增殖，分别达到106、 106、 107 cfu/ml，并且多重 PCR 能 同时分别扩增沙门氏菌 invA 基因 284bp、大肠杆菌 phoA 基因 622bp 和金黄色葡萄球菌 nuc 基因 484bp 的特异性条带。相反，其他几种培养基则不能同时协 调增殖上述 3 种菌。他们认为 BSB 有较好的应用前 景[10]。还有人[11]为探索高效的幽门螺杆菌培养和保 存方法，采用空肠弯曲菌琼脂加混合抗生素的马血清， 在微需氧条件下， 37 ℃培养 2 ～ 3 d，成功培养出幽门 螺杆菌，且增菌迅速;他们的结论是采用固体培养和保 存液低温液氮保存，能够较好保存且复苏率高。针对 空肠弯曲菌培养条件苛刻，菌株不易保存这一难题，有 人用7 种通常用于空肠弯曲菌保存的方法，进行了详 细的比较和研究，结果表明温度在 －70 ℃适合于菌株 的长期保存，温度在 2 ～8 ℃保存时间较短，但操作简 便，适用于菌株的暂时保存[12]。

呼吸道病原菌3 呼吸道病原菌保藏进展 流感嗜血杆菌( Hin) 是幼儿脑膜炎、菌血症、脓毒 性关节炎、肺炎、气管支气管炎、中耳炎、结膜炎、鼻窦 炎和急性会厌炎的主要病原菌。而在流感的病原微生 物检验工作中，成功进行细菌菌种保存，对于研究细菌 的生物学特征、探讨耐药性变异的机理、监测医院感染 病原流行趋势以及开发新药等至关重要。某教研室尝 试了4 种流感嗜血杆菌的保存方法，其中包括甘油血 清肉汤法、脱脂牛乳法、纸片法和真空冷冻干燥法，保 存1 个月、 3 个月、 6 个月、 1 年后将菌种复苏进行比 较，试图从中找到一个最佳的保存方法，通过对比实 验，研究者建议把脱脂牛乳法作为菌种保存的推广方 法，因为其既可以短期保存苛氧菌，也应该可以用于其 它细菌的保存，他们正在进一步观察其他临床标本保 存于以上 4 种方法的实用性和稳定性[13]。同期有 人[14]报告采用脱脂牛奶和脱纤维羊血两种方法保存 流感嗜血杆菌菌种，认为存活力较好，不需特殊设备， 至少可存活3 个月以上，方法简单、可行。但该方法是 否可广泛应用于其他苛养菌的菌种保存，以及保存期 限可否更长，有待进一步的研究。

接触传播病原菌4 接触传播病原菌及病原真菌保藏进展 淋球菌等奈瑟氏菌体外娇嫩难以保存，如何简单 而又可靠地长期保存淋球菌，一直是科研工作者关心 的课题。有研究者对目前几种保存淋球菌的方法进行 比较，鲜奶法、脱纤维血法、普通奶粉法和冷冻真空干 燥法4 种方法同时保存 85 株淋球菌。结果冷冻真空 干燥法1 年和2 年内复苏，复活率均为 100%; 鲜奶法 1 年内复苏，复活率为 100%， 2 年内复苏，复活率为 97． 7%，脱纤维血法1 年内复苏，复活率为 100%， 2 年 内复苏，复活率为82． 3%。上述 3 种方法明显高于普 通奶粉法组( 9． 4%， 1． 2%) ，差异具有显著性( P