[科普中国]-差异凝胶电泳

原理

差异凝胶电泳是以在双向电泳前先对蛋白样品进行荧光标记为基础的。荧光染料标记的方法分为两种: 最小标记法和饱和标记法，其中最小标记法较为常用。对于最小标记法，3 种用来标记的荧光染料Cy2、Cy3 和Cy5 是来源于N-羟基琥珀酰亚胺的衍生物，结构相似，可与赖氨酸残基侧链的ε-氨基基团进行亲核取代反应形成氨基化合物，所带正电荷与赖氨酸残基上被取代的电荷相匹配。3 种染料的分子量是相匹配的，使被标记蛋白增加大约0.5D。对优化的标记反应进行质谱分析，结果表明每个蛋白质分子被一个染料分子标记。

即使多个赖氨酸残基被标记，双标记所占的百分比很低，难以检测，故只有1% － 3%的蛋白样品被标记。最小标记法中染料与蛋白的最佳标记比例为每50 μg 蛋白样品采用400 pmol 荧光染料进行标记。对于饱和标记法，用来标记的两种荧光染料具有顺丁烯二酰亚胺反应基团，可与蛋白中半胱氨酸残基的硫醇基形成硫醚键，从而达到标记的目的。饱和标记法将对蛋白样品中所有可用的半胱氨酸残基进行标记，故需要大量的染料，被标记蛋白样品的比例很高。两种染料的分子量同样是相匹配的，使被标记蛋白增加大约0. 677 kD。不论是最小标记法或是饱和标记法，都可确保被标记的同一蛋白质在双向电泳胶中迁移到相同的位置。此种方法敏感度高，仅需5 μg 蛋白样品，对于比较珍贵的实验样品( 人类的器官、组织等) 更具有优势1。

应用差异凝胶电泳技术虽然市场化时间不长，但因其更高的敏感度及更精确的定量，而在医学、植物、细菌、昆虫等生物学领域的研究中应用。尤其是在与人类疾病相关的各种病变细胞与正常细胞蛋白质的比较方面的应用，为人类对致病潜在候选蛋白的鉴定、对临床样品的检测及深入研发抗病变药物等的研究提供了理论依据。

医学García-Ramírez 等将差异凝胶电泳技术及质谱技术相结合，对患有糖尿病视网膜病变的患者以及患有先天性黄斑裂孔的非糖尿病患者的玻璃状液总蛋白进行研究。结果表明，患有糖尿病视网膜病变的患者其玻璃状液中有11 种蛋白表达量发生了变化，其中8 种蛋白表达量上调，3种蛋白表达量下降。从这11 种蛋白中选取5 种，进行Western 杂交试验，结果显示这5 种蛋白表达量变化与差异凝胶电泳技术分析结果一致，进一步证实了差异凝胶电泳技术的精确定量能力，并对糖尿病视网膜病变致病机理中潜在的新候选蛋白的鉴定工作提供了有力帮助。

植物、细菌植物在其生长周期中会遇到一系列生物和非生物胁迫。环境因素如强光、干旱、高温或低温，以及盐浓度都会影响植物的生长发育，导致作物减产。在这些不利因素的影响下，植物本身已形成一系列的防御机制1。