[科普中国]-肉与肉制品：维生素E含量测定

原理

试样经皂化后，用石油醚提取不皂化的维生素E，浓缩后，用高效液相色谱仪测定，用外标法计算样品中维生素E的含量。

试剂除特别标明外，所用试剂均为分析纯。

（1）水：符合GB/T 6682-2008规定的一级水。

（2）无水乙醇。

（3）石油醚：沸程30～60℃。

（4）无水硫酸钠。

（5）异丙醇。

（6）甲醇：色谱纯或重蒸后使用。

（7）氢氧化钾溶液（500g/L）:称取50g氢氧化钾，溶于水中，用水稀释至100mL。

（8）抗坏血酸溶液（100g/L）:称取10g抗坏血酸（维生素C），溶于水中，用水稀释至100mL。

（9）α-生育酚标准物质：DL-α-生育酚或DL-α-生育酚醋酸酯。

（10）α-生育酚标准溶液

①标准贮备液（1000ug/mL）

若标准物质为α-生育酚，则称取50.0mg，用异丙醇溶解，定容于50mL棕色容量瓶中。4℃保存。

临用前用紫外分光光度计按“标准溶液的标定”标定其浓度。

若标准物质为α-生育酚的酯类物质，则称取50.0mg，按“分析步骤”进行皂化、提取、浓缩，用异丙醇溶解，定容于50mL棕色容量瓶中。4℃保存。

②标准工作液

用异丙醇将已标定浓度的标准贮备液稀释成所需的标准工作液。

临用前配制。

③标准溶液的标定

移取α-生育酚标准贮备液100uL于5mL具塞试管中，用无水乙醇稀释至3mL，于波长294nm处用紫外分光光度计测定α-生育酚的吸光度值。

按下式计算α-生育酚标准贮备液的浓度：

式中：

c1：α-生育酚标准贮备液的浓度，g/mL;

A：α-生育酚的紫外吸收值；

Ecm：α-生育酚的1%比吸光系数，即溶液浓度为1%、光路为1cm时的吸收系数，值为71；

V1：移取α-生育酚标准贮备液的体积，uL。

仪器和设备实验室常规仪器及下列仪器。

（1）机械设备：用于试样的均质化，包括高速旋转的切割机，或多孔板的孔径不超过4mm的绞肉机。

（2）旋转蒸发仪。

（3）液相色谱仪：带紫外或荧光检测器。

（4）紫外分光光度计。

取样实验室所收到的样品应具有代表性且在运输和储藏过程中无受损或发生变化。

取样方法参见GB∕T 9695.19。

取有代表性的样品200 g。

试样制备使用适当的机械设备将试样均质。注意避免试样的温度超过25℃。若使用绞肉机，试样至少通过该设备两次。

将试样装入密封的容器里，防止变质和成分变化。试样应在均质化后24 h内尽快分析。

分析步骤注：维生素E易被氧化,实验应避光或充氮操作,并使用棕色玻璃仪器。

皂化称取0.5～5g（准确至0.001g）试样于150mL烧瓶中，加入抗坏血酸溶液3mL，氢氧化钾溶液5mL，无水乙醇30mL，混匀，于沸水浴上回流15～30min，使试样溶液清澈，皂化后于流水中冷却。

提取将皂化后的试样溶液移入125mL分液漏斗中，用30mL石油醚分数次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中，塞上塞子，轻摇分液漏斗，避免乳化。静置，待分层后，将水层放入第二个分液漏斗中，醚层留在第一个分液漏斗中，于第二个分液漏斗中倒入10mL石油醚，进行第二次提取，如此进行3～4次，石油醚层并入第一个分液漏斗中。

石油醚层反复用水洗涤，直至水层呈中性(pH约为7)，弃去水层。将分液漏斗中石油醚层经过无水硫酸钠脱水后，放入棕色圆底烧瓶中，用少量石油醚洗涤无水硫酸钠和分液漏斗，洗液并入棕色圆底烧瓶中。

分析试样溶液的制备将盛有石油醚提取液的圆底烧瓶与旋转蒸发器连接，于40～60℃水浴上减压蒸馏石油醚，待瓶内只剩约1～2mL液体时，取下烧瓶，用氮气吹干剩余液体，立即加入2.0mL异丙醇，塞上塞子,以防溶剂挥发。此为色谱分析用样液。

测定液相色谱参考条件

色谱柱：C18柱（150mm×4.6mm，5μm），或相当者；

流动相：甲醇；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

检验器：紫外检测器：波长292nm；荧光检测器，激发波长为298nm，发射波长为325nm；

进择量：20μL。

标准曲线的绘制

将α-生育酚系列标准工作液进行高效液相色谱分析，记录峰面积或峰高，以α-生育酚的浓度为横坐标，以相应的峰高或峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

注：α-生育酚应能与β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚分离

试样溶液的测定

将制备好的试样溶液按标准工作液的液相色谱条件进行测定。根据试样溶液的峰面积或峰高，从标准曲线上查出对应α-生育酚的浓度。

平行试验按“分析步骤”，对同一试样进行平行试验测定。

空白实验除不加入试样外，均按“分析步骤”进行测定。

计算式中:

X：试样中α-生育酚的含量，mg/100g；

c2：根据试样的峰面积或峰高查标准曲线得到的α-生育酚的浓度，μg/mL；

V2：试样液最终定容的体积，mL；

m：试样质量，g。

计算结果应扣除空白，结果准确至0.01mg/100g。

精密度同一分析者在同一实验室采用相同的方法和相同的仪器，在短时间间隔内对同一样品独立测定两次，两次测试结果的绝对差值不得超过算数平均值的30%。1