[科普中国]-保健食品中维生素B12的测定

前言

本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。
本标准起草单位:中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。
本标准主要起草人:杨大进、鲁杰。

范围
本标准规定了保健食品中维生素B12的测定方法。
本标准适用于片剂、胶囊、粉剂、功能性饮料类型保健食品中维生素B12的测定。
本方法使用固相萃取法处理样品时，取样量为2.0g，方法的检出限为1.0μg/g。当应用免疫亲和法处理样品时，片剂、胶囊、粉剂取样量为2.0g，方法的检出限为0.055μg/g；功能性饮料取样量为20 mL，方法的检出限为3.0 μg/L。1

原理
采用固相萃取法或免疫亲和色谱法对试样提取液中的维生素B12进行富集并去除部分杂质，高效液色谱分析。

试剂除非另有规定，本标准中所用试剂均为分析纯。实验用水均为实验室一级用水，电导率(25℃)为0. 01 mS/m。
乙睛(C2H3N):色谱纯。

甲醇(CH4O):优级纯。
乙醇(C2H6O)。
四丁基氯化铵(C16H36NCl) 。

5%四丁基氯化铵(C16H36NCl)溶液:称取5. 0g四丁基氯化铵，加水溶解并稀释至100 mL 。
三氯甲烷(CHCl3 ) 。
三氟乙酸(C2F3O2H) 。
柠檬酸(C6H8O7)。
磷酸二氢钾(KH2PO4 )。
氢氧化钠（NaOH)。
磷酸缓冲液(pH6.5):取磷酸二氢钾0.68 g，加0. 1 mol/L氢氧化钠溶液15. 2 mL，再用水稀释至100 mL。
维生素B12标准品:纯度≥99%。
5%乙睛:量取50mL乙睛，用水稀释定容至1000 mL。
25%乙睛:量取250 mL乙睛，用水稀释定容至1000 mL 。
维生素B12标准储备液:称取维生素B12标准品10mg(精确至0.1mg)，用5%乙醇溶解，并定容至10 mL棕色容量瓶中，混匀，得到维生素B12的标准储备液。冷藏保存。
维生素B12标准中间液:吸取1mL储备液至25mL棕色容量瓶中，用水稀释得到维生素B12的标准中间液。冷藏保存。
维生素B12标准系列:分别吸取0.05 mL,0.10 mL,0.50 mL，1.00 mL,2.00 mL,5.00 mL的标准中间液于10 mL棕色容量瓶中，用水稀释得到维生素B12标准溶液系列。1

仪器和设备高效液相色谱仪，附紫外检测器。

超声波清洗器。

离心机:4 000 r/min。

固相萃取柱:N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯基苯亲水亲脂平衡型固相萃取柱(60mg, 3 mL)。

免疫亲和净化柱:维生素B12免疫亲和净化柱(EASI-EXTRACT. VITAMINE B12)。

固相萃取法(前处理方法一)操作步骤试样处理

将20粒片剂、胶囊试样粉碎或混匀;粉剂试样取5包~10包充分棍匀。

提取

称取试样4 g ~10 g(相当于含维生素B12 4 μg左右，精确至0. 001 g)于50 mL离心管中，加10 mL~15 mL水，混匀，将其置于超声波清洗器中，超声提取约10 min后以4 000 r/min离心5 min。用吸管吸取上清液置于另一个50 mL离心管中。对残渣按上述步骤每次加人约10 mL水，重复提取两次，合并提取液于50 mL离心管中。

净化

向提取液中加人5%四丁基氯化铵溶液1 mL、三氯甲烷约20 mL，使用涡旋混匀器充分混匀，于离心机中以1 000 r/min离心3 min。将水层转入蒸发皿中，置水浴锅上加热蒸发至干。残渣用乙醇溶解，转移至离心管中，超声溶解，离心，吸取上清液于蒸发皿中。再重复提取两次，合并提取液于蒸发皿中。蒸干乙醇，试样用5mL5%乙睛溶液定量转移到试管中，待上固相萃取柱。

固相萃取

固相萃取柱先用3 mL甲醇进行活化，再用3 mL水对固相萃取柱进行平衡，速度为1滴/s。将上述处理过的适量试样加到固相萃取柱上。上样后，用5 mL 5%乙睛溶液作为洗脱溶剂将干扰物质从固相萃取柱上淋洗下来，最后用25%乙睛溶液将维生素B12洗脱下来，收集洗脱液0.5 mL。1

免疫亲和法(前处理方法二)操作步骤试样处理

碳酸型功能性饮料:取150 mL样液于超声波中脱气10 min，待用。

果粒或果汁型功能性饮料:用1 mol/L氢氧化钠调pH至7. 0，置离心机中以转速4 000 r/min离心10 min，过滤，滤液待用。

片剂、胶囊、粉剂:取20粒片剂、胶囊试样粉碎或混匀。粉剂试样取5包~10包充分混匀。

称取试样10 g~50 g(相当于维生素B12的量为25μg~2 500 μg，精确至0. 001 g)于250 mL容量瓶中，加人100 mL水，振摇混匀，将其置于超声波清洗器中，超声提取约15 min后用水定容，稀释样品溶液的浓度到样品中维生素B12的含量为25μg/mL。如样品溶液的pH在7. 0以上，用柠檬酸调节pH在4. 5 ~7. 0之间;如样品溶液的pH在4. 5以下，则应用磷酸缓冲液代替水作为提取液并重复上面步骤。1

富集、净化

维生素B12免疫亲和净化柱先用10 mL水淋洗小柱中未键合的化合物，吸取24 mL提取液上样到净化柱上，再用3 mL甲醇洗脱维生素B12至蒸发皿中，整个过程速度约为1滴/S。于60℃~70℃水浴中蒸干溶剂，用1 mL 0. 025%的三氟乙酸溶液溶解，溶液过0.45μg水系滤膜，待高效液相色谱用。

液相色谱参考分析条件色谱柱:C18 (4.6 mm X 250 mm, 5μm)反相色谱柱。

流动相:采用梯度洗脱方式，见表1。1

|| || 表1 流动相梯度洗脱表

流速:1 mL/min 。

检测波长:361nm。

柱温:室温。

测定吸取20 μL标准溶液和试样溶液注人高效液相色谱仪中，以保留时间定性，用标准曲线法进行测定。

结果计算按式(1)计算试样中维生素B12的含量。

…..........…(1)

式中:

X—试样中维生素B12的含量，单位为微克每克或微克每毫升(μg/g或μg/mL) ;

A—从标准曲线上查得的含量，单位为微克(μg) ;

f—试样稀释倍数;

m—试样的取样量，单位为克或毫升(g或mL) 。

计算结果保留两位有效数字。1

精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。

色谱图维生素B12标准色谱图见图1。1