[科普中国]-游离棉酚

研究历史

英国化学家Longmore在1886年从棉籽中分离出来棉酚，俄国人Marchlewski在1899年从棉籽油的废渣中分离出纯的棉酚，它是一种黄色色素物质，被用来做为染料，但是发现这个色素很不稳定，特别是在光照条件下不稳定。1906年，科学家Cook研究发现了棉酚对棉花病虫害防治的重要性。1915年，Withers研究发现了棉籽粕中棉酚具有毒性，之后又发现了棉籽粕中的棉酚对动物也具有毒性。1927年，Clark对棉酚的分子结构进行研究，得到分子式为C30H30O8。1938年，Adams确定了棉酚的结构，指出棉酚能发生很多化学反应。1958年，Edwards对棉酚进行合成，再次验证棉酚的结构。20世纪60年代开始，外国学者对棉酚的旋光异构体进行研究，左旋棉酚的毒性和药理活性均高于右旋棉酚。60年代初，科学家研究发现棉酚具有抗肿瘤的作用。1978年，我国学者研究表明棉酚能被用来作男性节育药，但副作用是低血钾症和不可逆不育。后来棉酚被应用于治疗女性子宫内膜异位症、痛经和子宫肌瘤等，是棉酚研究上的又一个进展。此外棉酚还具有抗病毒和免疫作用，具有很大的应用前景和经济价值。20世纪以来，棉酚的研究内容主要包括棉酚的毒性及脱毒方法、理化性质、棉酚的提取与合成、棉酚的抗生育等药理活性和棉酚旋光异构体的拆分等。

性状与特质棉酚是锦葵科棉属植物色素腺产生的多酚二萘衍生物。棉酚及类棉酚色素集中在棉籽仁的球状色腺体中，色腺体周围为棉籽仁的肉质，其在棉籽中的含量约为0.7%~4.8%，其中在棉籽壳中含量约为0.005%~0.01%，在棉仁中含量约为0.5%~2.5%，棉仁中存在着占仁重约为1.5%~2.7%的棉酚腺体，其色泽由淡黄色至樱桃红，是棉籽中含棉酚最密集的部分，棉酚占腺体重量的35%~50%左右。色腺体中还存在其它类棉酚色素，如棉酚嘌呤约占0.05%~13%。棉仁中棉酚的存在形式有两种，即游离棉酚和结合棉酚，两者之和称为总棉酚。游离棉酚是指在棉仁组织中呈游离状态存在的棉酚；而结合棉酚是棉酚与其他物质（主要是蛋白质）结合的产物。只有游离棉酚对人畜具有毒性。

棉酚是一种从棉籽中分离出来的黄色的色素物质，是倍半萜多酚型物质——多酚轻基联萘化合物，其分子式为C50H50O8，分子量为518.54。具有半缩醛型、烃基醛型和烯醇型三种互变异构体。由于棉酚具有醛基、羟基等官能团，故化学性质较活泼。棉酚易溶于有机溶剂，如丙酮、乙醇、乙醚、甲醇、乙腈、氯仿等，可用于棉酚的提取，难溶于己烷和高沸点的石油醚，不溶于水和低沸点的石油醚。棉酚易被氧化剂氧化而变质，导致颜色逐渐加深，且容易和醋酸反应生成醋酸棉酚，和甲酸反应生成甲酸棉酚，和苯胺反应生成稳定的非离子化合物，而这些物质在加热的作用下会重新分解，可以用来精制和提纯棉酚。棉酚具有酸性，能够与碱反应生成棉酚盐而溶于水，利于棉酚与油分离。

毒性与危害游离棉酚是具有活性醛基和活性羟基的棉酚，其毒性较大，在生物体内与酶和蛋白质结合，破坏蛋白质的可消化性，使胃黏膜组织易受破坏并引起消化功能紊乱，含量超过安全界限，将导致生长迟缓、中毒及死亡。此外，由于棉酚能与蛋白质中赖氨酸的 ε－氨基酸结合，赖氨酸的有效成分被大大降低了，其营养价值也被减低了。

游离棉酚毒性主要由活性醛基和活性羟基产生毒性而引起多种危害，大量棉酚进入消化道后可刺激胃肠粘膜引起胃肠炎，并能增加血管壁的通透性，使血浆、血细胞渗到外周组织，使受害组织发生血浆性浸润。进入血液后能损害心、肝、肾等质性器官，另外在体内能与蛋白质和铁等结合，使体内一些功能蛋白酶失活，与铁结合则易导致缺铁性贫血。此外还能影响雄性动物的生殖机能造成性不育；影响蛋品质，使其蛋黄变为绿色或红褐色。1

检测与分析目前游离棉酚的检测研究大多集中在对棉籽仁、棉粕及棉籽油的检测，对生物样品的检测报道较少，分光光度法和高效液相色谱法(HPLC)是游离棉酚检测的两种常用方法。其中分光光度法中又有AOCS法、国标法、Smith法，HPLC法具有更高的准确性。此外还有薄层色谱法(TLC)，高效毛细管电泳法，高效液相色谱—质谱联用法及高效液相色谱串联质谱法，后两者则主要应用于游离棉酚含量较低的生物样品的测定。我国现行饲料卫生标准对饲料中游离棉酚的允许量规定为≤1200mg/Kg。GB5009.148-2011规定，棉籽油中游离棉酚含量不超200mg/Kg。2

分光光度法分光光度法中的国标方法适用于测定棉籽油。原理是将70%的丙酮作为提取溶剂，游离棉酚在378nm处有最大吸收，测定不同浓度棉酚标准品的吸光值并绘制出标准曲线，同时测定样品的吸光值并与标准曲线比较而定量。虽然这种方法操作简便，但是准确性较差。苯胺法是1962年由Smith首创的棉酚测定经典方法，该方法的特点在于快速、准确并且成本低，目前被作为我国饲料中游离棉酚测定的现行国家标准3，主要适用于棉籽饼、棉籽粕和含这些物质的配合饲料中游离棉酚含量的测定。该方法的基本原理采用异丙醇与正己烷的混合溶剂对游离棉酚进行提取，并与苯胺反应将棉酚转化为苯胺棉酚，于最大吸收波长440nm处测定吸光值。AOCS（美国油脂化学协会）法结合了以上两种紫外方法，用国标法的提取溶剂，加入苯胺，在445nm波长下测定游离棉酚的吸光值。贺秀媛4等在饲料中游离棉酚测定的国家标准基础上，对该方法进行改进，将振荡提取改为自然浸提，操作更加简便，与国标法相比游离棉酚含量测定结果无显著性差异。

高效液相色谱法高效液相色谱法是比较灵敏且准确的游离棉酚测定方法。我国出台了植物性食品中游离棉酚检测的高效液相色谱法2，该方法适用于植物油或以棉籽饼为原料的其他食品，以无水乙醇为溶剂振摇提取，流动相为甲醇:2%磷酸=85:15，检测波长235nm。在动物体内游离棉酚检测方面，崔晓明5等建立高效液相色谱法检测肉样中游离棉酚含量，用70%的丙酮溶液提取游离棉酚，流动相乙腈:0.2%甲酸=85:15，检测波长235nm，结果游离棉酚的保留时间为7.8min，回收率、精密度及RSD符合残留分析要求，对市场上的肉样进行检测，未检出游离棉酚。棉酚旋光异构体含量测定的关键在于游离棉酚的拆旋，原理是将棉酚的醛基与手性氨基化合物进行缩合，其产物的理化性质，尤其是色谱行为差异较大，再用高效液相色谱仪进行分离和检测。2007年，农业部出台了棉籽中棉酚旋光异构体测定的HPLC法6，该法所采用的拆分试剂为L-苯基丙氨醇，与游离棉酚发生衍生化反应，分别生成(-)-棉酚-L-苯基丙氨醇和(+)-棉酚-L-苯基丙氨醇，以甲醇:水:磷酸=85：15：0.1为流动相，在C18柱上两者有不同的保留时间，从而达到分离，检测波长为254nm，左旋棉酚衍生物保留时间在4min左右，右旋棉酚衍生物保留时间在6min左右。吴大方69等采用高效液相色谱法检测人血浆中左旋棉酚和右旋棉酚含量，该法采用2-氨基1-丁醇为拆分试剂，甲醇:异丙醇:水:磷酸=80：20：20：0.1为流动相，波长254nm，右旋棉酚衍生物与左旋棉酚衍生物的保留时间分别为4min和8min。林立行等]采用HPLC电化学检测器测定大鼠血液、睾网液及附睾液中左旋棉酚和右旋棉酚含量，通过静脉注射左旋棉酚或右旋棉酚于大鼠体内，使棉酚蓄积，样品用乙腈沉淀蛋白，氯仿提取棉酚，流动相为甲醇：0.1mol/m L磷酸盐缓冲液=90：10，电压0.7V，结果线性范围为1～6μg，回收率及RSD均符合生物样品测定要求。何晓文等2012年以(R)-(-)-2-Amino-1-propanol为拆分试剂，对棉籽中游离棉酚进行衍生化，测定其中左旋棉酚和右旋棉酚含量，HPLC色谱条件为乙腈：10m MKH2PO4（磷酸调p H3.0）=80：20，流速为1.0m L/min，检测波长为247nm，右旋棉酚衍生物保留时间5.5min，左旋棉酚衍生物保留时间8.8min。

薄层扫描法薄层扫描法是以丙酮或乙醇溶液提取样品，经过滤后用薄层扫描仪扫描棉酚色斑光密度积分值，再与标准色斑进行比较，即可得出样品中游离棉酚含量。根据Rf值可对待测物质作定性鉴定，根据斑点面积或颜色深浅可作定量分析。沈静7等用高效薄层色谱法测定棉籽油中游离棉酚含量，采用0.5%CMC-Na硅胶G高效薄层板，展开剂为甲苯：甲酸乙酯:甲酸:丁酮=50:8:1.5:1，显色剂为饱和三氯化锑氯仿溶液，双波长紫外反射法扫描，检测波长550nm，参比波长750nm，结果棉酚对照品溶液点样量与峰面积在线性范围0.08～1.28μg内呈良好线性关系，平均回收率为91.5%～100.2%。

高效毛细管电泳法(HPCE)高效毛细管电泳法(HPCE)相比高效液相色谱法成本低，但重复性差，研究报道少。姚军8等采用HPCE法测定新疆南疆地区棉籽仁中游离棉酚含量，毛细管柱长度78.5cm、内径75μm，分离电压为20kv，进样量为0.5psi×10sec，温度为25℃，缓冲盐为0.01%mmol/L的四硼酸钠-磷酸(p H=8.0)，检测波长235nm，结果棉酚在5.0～50.0μg/m L范围内呈良好线性关系，回收率97.5～98.4%，游离棉酚在棉籽中含量为0.60～1.04%。Sergey Vshivkova等采用毛细管电泳法检测棉花花瓣和种子中的棉酚对映体，采用有效长度24.5、内径50μm的毛细管柱，分离电压15kv，温度15℃，硼酸缓冲液(p H=9.3)，结果表明该方法准确度高，检测限为36ng/m L，在6min内棉酚对映体达到分离。

高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS)高效液相色谱质谱联用法(HPLC-MS)及高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)比较适用于生物样品中较低浓度的游离棉酚及其代谢产物的检测，灵敏度好，专属性高。卞小洁9等建立了检测人血浆中棉酚的HPLC-MS法，血浆样品中游离棉酚用乙醚进行提取，流动相为乙腈：30mmol/L醋酸铵（含1%甲酸和0.3%四氢呋喃）=85:15，负离子模式，选择性离子监测，棉酚的检测离子为517.2，内标物甘草次酸的检测离子为469.3，氮气流速7L/min，雾化室压力40psig，氮气温度350℃，毛细管电压4000V，结果棉酚的保留时间3.6min，甘草次酸的保留时间3.1min，准确度和精密度符合要求，可用来测定生物样品中游离棉酚含量。施琦贻采用高效液相色谱串联质谱法测定鲜蛋黄中游离棉酚的含量。用丙酮提取蛋黄样品中的游离棉酚，C18色谱柱进行色谱分离，以甲醇:1%甲酸=90:10为流动相，采用多反应监测模式，棉酚的定性离子对为517.4/259.3，定量离子对为517.4/231.3。游离棉酚含量在1～100ng/m L范围内线性关系良好，定量限为1ng/m L，平均回收率和RSD均符合测定要求。

提取与制备棉酚的制备可以从棉仁粉、棉籽饼粕和棉籽油、皂脚中得到，先将游离棉酚转化为苯胺棉酚、醋酸棉酚，然后经水解精制得到纯棉酚。

棉酚的制取，普遍采用了溶剂提取一苯胺沉淀法。利用棉酚在极性溶剂中溶解度大，将棉仁直接浸泡在溶剂中，在浸出液中加入苯胺使游离棉酚与苯胺定量生成苯胺棉酚沉淀全部析出，将其沉淀过滤，再进一步后处理和精制醋酸棉酚粗品。因此，作为一种中间产物，苯胺棉酚的生成量多少将直接影响着醋酸棉酚的含量，常见的浸取溶剂有丙酮、异丙醇、乙醇等。获得中间产物苯胺棉酚之后，在酸性环境下，苯胺棉酚可转化为醋酸棉酚，最后水解精制、浓缩结晶获得纯棉酚。

用途在医药方面的应用棉酚最重要的应用是在医药方面，早在70年代我国医学工作者已经发现了棉酚的抗生育作用，经精制的醋酸棉酚用作男性节育药，明显降低了精子的成活率，证实棉酚是一种效果可靠的男性节育药。但是用苯胺法生产的棉酚在临床实验中，发现有0.99%的实验者患低血钾肌无力症。一般认为是苯胺棉酚在转化为醋酸棉酚时可能因转化不完全而使部分单苯胺棉酚，甚至是二苯胺棉酚残留在醋酸棉酚中，引起了低血钾症。现在出现了一种新的途径来利用棉酚进行抗生育实验,即将低剂量棉酚(一般有效剂量的0.2%)与多聚乳糖酸连接，制备成药物缓释系统，直接注入输精管进行高效杀精。这种方法持续、直接、有效且无副作用，保持了棉酚的强抗受精作用，同时降低了其毒副作用。10

棉酚除了可作为男性抗生育用药外，也可适用于治疗女性某些激素依赖性疾病，如子宫内膜异位症、子宫肌瘤、功血和痛经等。棉酚具有抗疟疾的作用，可杀死疱疹等病毒。此外,棉酚还对胃癌、肺癌、肝癌、结肠癌等有一定的疗效。

在工业方面的应用棉酚及其某些衍生物具有抗氧化剂的性质，因此，可用作氧化抑制剂。棉酚在橡胶工业、聚乙烯工业、聚丙烯工业以及作为火箭燃料中的抗氧化剂方面的应用已有相关报道。虽然棉酚有很高的抗氧化能力，但是因为本身的微弱毒性，限制了棉酚在食品行业中的应用，一般仅做为化工产品的抗氧化剂。另外，棉酚还可以做为石油、机械加工、筑路方面的稳定剂。