[科普中国]-木质素过氧化物酶

简介

木质素是一类结构复杂、稳定的生物大分子物质。其产量仅次于纤维素。我国秸秆类物质资源丰富，但木质素约占其20%，由于动物体内缺乏降解木质素的酶类，因此其饲料价值较差。研究表明，通过微生物酶的降解作用，可将饲料原料中的木质素分解为可被动物吸收利用的小分子物质，从而提高其饲用价值1。木质素过氧化物酶(LiP)是木质素的生物降解过程中的主要木质素降解酶类，可在木素聚合物内形成自由基。导致键稳定变差从而破坏木质素大分子。

木质素过氧化物酶的特性与来源1983年，有人首次从白腐真菌属的黄孢原毛平革菌的限制性培养基中发现了LiP。并认为其属于氧化还原酶，是真菌分泌的一种含铁血红素的糖基化细胞外蛋白过氧化物酶。研究表明，LiP的糖基化亚铁血红素蛋白质通常以多种复合的形式产生，即含有多种同下酶。分子质量一般在37～47 kDa。经过纯化后的LiP的分子质量在40 kDa左右，等电点为3.5左右，最适酶活温度为35～55℃，最适pH为2-5。LiP氧化还原电位为1.5 V，在H2O2存在时，LiP能氧化分解芳香环多聚体。被认为是木质素降解的关键酶之一。LiP主要是由微生物分泌所产生，如黄孢原毛平革菌、彩绒革盖菌、变色栓菌、烟管菌、射脉菌、凤尾菇和朱红密孔菌等。1989年，有人研究发现，革兰氏阳性菌T7A也可产生Lip。

木质素过氧化物酶的催化机制及酶活测定催化机制LiP是一系列含Fe3+、卟啉环和血红素辅基的同工酶。1988年有研究人员发现，LiP可利用H2O2及有机过氧化物催化一系列底物，其催化作用具有非特异性。另外，有研究也发现LiP的作用底物很广泛。主要包括酚类和非酚类芳香化合物，可以氧化木质素单体、二体、三体以及多环芳烃(如苯并芘)等底物。其降解底物的特点为：LiP能氧化富含电子的酚型或非酚型芳香化合物。在通过电子传递体攻击底物时，能从苯酚或非酚类的苯环上夺取一个电子，将其氧化成自由基，继而以链式反应产生许多不同的自由基。导致底物分子中主要键断裂，然后发生一系列的裂解反应。

酶活测定LiP酶活的测定主要采用黎芦醇氧化速率法。由于黎芦醇是LiP作用的直接底物，根据310 nm处测得的黎芦醇的吸光度值大小来判定LiP的酶活。具体方法为：1 mL反应液中含0.2 mL藜芦醇溶液、0.4 mL酒石酸缓冲液(250 mmoL/L，pH 3.0)、0.4 mL培养液或稀释液、20μL 20mmoL/LH202溶液，于30℃反应2 min，测定310 nm的吸光度值。在空白组中，以蒸馏水代替H202溶液，其他反应物不变。1个酶活单位(U)的定义为每分钟氧化黎芦醇产生1 μmol黎芦醛所需的酶量。

木质素过氧化物酶的生产游离培养木质素过氧化物酶游离培养LiP合成的主要影响因素为培养基的成分和培养条件(氧浓度)。2005年张红等在限碳静置、限氮振荡不加藜芦醇的环境下，研究发酵条件对黄孢原毛平革菌合成LiP影响的结果显示：限碳静置培养时，酶活可达1193 U/L。碳源以葡萄糖0.04%和糊精0.16%同时存在比单一葡萄糖作为碳源获得较高的酶活；限氮振荡培养时，所得酶活可达980 U/L。2003年毕鑫等2在静置和振荡两种培养条件下研究营养条件对白腐菌合成LiP影响的结果表明：静置培养时，LiP在碳氮比低的培养基中显示较高的酶活力，碳源以葡萄糖0.02%和糊精0.18%同时存在或分段加人要比单一葡萄糖作为碳源时获得更高的酶活；振荡培养时，在碳氮比高的培养基中LiP酶活最高。而类似于静置培养的氮源组合及分段模式却明显抑制LiP的合成；优化后，静置培养在第6天可获得7560 U/L的酶活，振荡培养在第8天获得6500 U/L的酶活。2000年柯世省等3研究发现，氧浓度对固定化黄孢原毛平革菌合成过氧化物酶影响较大，空气环境下限碳培养黄孢原毛平革菌，其合成的LiP最高活力可达360 U/L。比通纯氧条件下限碳培养时高160%。

固定化培养木质素过氧化物酶近年来，采用固定化细胞培养合成LiP已得到了广泛的重视，与游离细胞培养相比，其能更有效地合成LiP。目前已采用多种载体对黄孢原毛平革菌的固定，其中用尼龙网、硅管、聚丙烯、不锈钢、琼脂糖和琼胶颗粒等均取得了较好的效果。固定化后的菌丝稳定性增强并且可以重复利用。2008年吴叶明等4用大孔吸附树脂进行黄孢原毛平革菌来源的LiP固定化试验的结果表明，在树脂1.0 g、酶液pH 4.5、加酶量87.2 U、吸附温度25℃、吸附4 h、0.2%戊二醛、处理120 min条件下，可获得最佳的固定化效果，固定化酶活可达到16 U/g。2009年刘东华等通过共价结合法将LiP固定于聚氨酯泡沫上，发现固定化酶活为1.45 U/g(泡沫干重)，酶活回收率达到34.79%，提高了固定化LiP的热稳定性。且扩大了固定化LiP稳定性的pH范围，且其重复利用性好。

利用反应器生产木质素过氧化物酶目前，有很多关于利用生物反应器生产LiP的报道。由于LiP胞外生产的特点要求，因此除了必须满足菌体需要的营养限制(限碳或限氮)、足够的供氧等环境条件外，还应避免其胞外酶的结构及活性遭受剪切力等因素的破坏。与游离和固定化培养相比，生物反应器有以下几个特点：能够控制内部流体混和均匀、剪切力适宜：为了给细胞生长和目标产物酶的合成提供最佳的环境条件。需要能够对反应器中的pH、温度、溶解氧、氧化还原势、搅拌转速等参数进行测量和控制：必须防止杂菌污染，维持纯种培养等。所以利用生物反应器本身的结构和运行参数对其产酶至关重要。

目前主要使用以下几种生物反应器来生产LiP。2002年，Couto等在机械搅拌式反应器中实现了固体培养，LiP酶活均值高达246.8 U/L。2001年Dominguez等采用转鼓式生物反应器半浸没培养黄孢原毛平革菌，LiP的酶活达364 U/L。2003年张朝晖等在三相鼓泡塔反应器中培养黄孢原毛平革菌，在通气量为1.0 L/(L·min)时，LiP酶活最高达367 U/L。2003年，Ruggeri和Sassi利用滴流床生物反应器间歇培养黄孢原毛平革菌，LiP酶活达1220 U/L。2002年，Shim和Kawamoto把生长培养基和诱导培养基交替通入到8 L的固定床反应器中间歇培养合成LiP。其最高酶活为1800 U/L。而1997年，Gerin等比较了由气体搅动的气升式反应器、鼓泡式反应器和有螺旋桨搅动的搅拌式反应器后发现，使用气升式反应器LiP酶活的最大值达4500 U/L。综合上述研究可以发现，使用气升式反应器能够获得更高的LiP的酶活。

木质素过氧化物酶的应用在畜牧生产中2002年，赵红霞等利用白腐真菌降解秸秆中的木质素和纤维素，使其成为含有酶的糖类。提高了秸秆的适口性，易于消化吸收。2005年，Celeux和Lavergne利用白腐真菌的菌丝分泌的超纤维氧化酶可溶解秸秆表面的蜡质，菌丝进入秸秆内部并产生纤维素酶、半纤维素酶、内切聚糖酶、外切糖酶，从而可降解木质素和纤维素。其中机制可能为LiP和锰过氧化物酶(MnP)在分子氧的参与下，依靠自身形成的H2O2触发启动一系列自由基链反应，实现对木质素无特异性的彻底氧化，使秸秆降解成为含有酶的单糖，从而提高了秸秆的消化性。2008年，贾燕南等研究表明LiP和MnP可降解四环素．且在酶活为40 U/L时，LiP比MnP的降解能力强；对于LiP，当其酶活从15 U几升高至40 U/L时。四环素降解率提高约15%。当酶活进一步升高至70 U/L时，降解率变化不大。

其他LiP在降解有机污染物、生物制浆、处理污染废水等方面还有广泛的应用。2002年，张朝晖等研究表明，黄孢原毛平革菌所产的LiP能氧化多种多氯酚类物质，有些酚类物质常常是广谱生物杀虫剂或除草剂的前体。1996年，林鹿等报道，在LiP单独使用或与其他酶的适当配合处理纸浆，使得制得的纸张具有良好的抗张强度和平滑度，这不仅提高纸张白度而且还降低了纸张的卡伯值。2003年，Gary等研究发现LiP可以处理2，4一二溴苯酚等工业废水，在氧化的过程中形成二聚体、三聚体和四聚体，从而消除了废水的毒性5。