[科普中国]-米曲霉蛋白酶

定义

米曲霉蛋白酶种类繁多，目前已做检测的米曲霉蛋白酶包括 9 种酸性蛋白酶，3 种中性蛋白酶，6 种碱性蛋白酶。目前，在食品上应用比较广泛的产蛋白酶安全菌株主要有枯草芽孢杆菌，黑曲霉和米曲霉。其中米曲霉是一类产复合酶的菌株，主要产蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等，作为最重要的酶制剂而广泛使用。米曲霉蛋白酶在发酵豆制品的生产过程中起着举足轻重的作用，已应用一千年之久，主要是通过蛋白酶的作用将大分子蛋白质降解为蛋白胨、多肽及各种氨基酸（含有 8 种人体所需的必需氨基酸），提高了大豆的营养价值、保健功效和消化率。在酱油和豆酱发酵过程中，具有很强的蛋白酶合成能力，其蛋白酶在一个比较广的 pH范围内都具有活性，而且稳定性高，能耐受较高的温度，因此广泛应用。而且米曲霉含有丰富糖苷水解酶将淀粉或纤维素等廉价原料高效生产蛋白酶，所以是食品用蛋白酶的主要来源菌株。1

结构酶的催化性质与酶分子的结构密切相关。特别是酶的三级结构，对酶对催化机制有重大影响，同一种酶,由于高级机构的不同，参与的反应可能就不同。郭继平等采用结构生物学和生物信息学手段对米曲霉碱性蛋白酶的三维结构进行了同源模建。通过序列相似性搜索蛋白序列数据库和布鲁克海文PDB蛋白结构数据库，找到了编号pdb|2B6N|A和pdb|11C6|A的蛋白质与米曲霉碱性蛋白酶序列同源性达到了45%和44%。随后又进行了模体搜索，结果显示米曲霉碱性蛋白酶具有Peptidase_S8结构域。故采用pdb|2B6N|A和pdb|lIC6|A为模板，利用SWISS-MODEL分子模建服务系统模建了米曲霉碱性蛋白酶三维结构。2

基因赵国忠等对相同培养条件下的不同米曲霉菌株之间进行了比较基因组学和蛋白质组学的研究，分析酱油发酵过程中米曲霉的关键基因和蛋白对酱油风味产生的影响。通过米曲霉3.042(中国卿米曲霉RIB40(日本)菌株的基因姐学比较，发现与酱油风味物质形成相关的特异基因。围绕米曲霉3.042及其诱变菌株米曲霉100-8的蛋白质组学比较，找到米曲霉代谢过程中与风味物质形成有关的蛋白，为酱油工艺的改进提供了理论基础。常淑君构建米曲霉WB40的全长cDNA表达文库，初级文库滴度约为2.96x106CFU/mL，重组率约为97.8%，插入片段平均长度大于1.5kb，达到一个高质量cDNA文库的要求。文库扩增后，滴度达到3.4x1010CFU/mL。对米曲霉基础生物学研究及相关基因的筛选与克隆奠定了基础。2

催化性质与动力学中性蛋白酶是米曲霉分泌的重要蛋白酶，目前酱油企业往往以中性蛋白酶的酶活力为指标之一来判断酱油曲的质量好坏。杨世平等研究了米曲霉中性蛋白酶的特性，指出米曲霉中性蛋白酶的最适反应温度为55°C，最适反应pH值为7.2，此酶的热稳定性较好。蒋爱凤等从白酒大曲中分离纯化米曲霉菌种，制大曲后，用生理盐水提取粗酶液，再用硫酸铵沉淀提取中性蛋白酶，并对其酶学性质进行研究。结果该中性蛋白酶的最适反应温度为55°C，最适反应pH值为7.0。NaCl和EDTA对该酶具有抑制作用。王栋等米曲霉CICIMF0899和沪酿3.042为研究对象，对2株菌种产蛋白酶的酶学性质进行比较研究，结果思示米曲霉CICIMF0899产的蛋白酶比沪酿3.042更耐高温、盐和低pH。

汤鸣强等对米曲霉菌种F-81所产中性蛋白酶进行分离纯化，得到一种电泳纯的中性蛋白酶，经SDS-PAGE电泳测定其相对分子质量约为73.4KDa。于艳颖等以对米曲霉HDF-7所产蛋白酶进行分离纯化，得到一种电泳纯的蛋白酶，经SDS-PAGE电泳测定其相对分子质量约为30KDa。由于酱油发酵pH值是在4.5-6偏酸性的环境，因此对酸性蛋白酶的研究也逐渐引起重视。胡稳奇等用水从米曲霉A-9005菌株的款曲培养物中抽提酸性蛋白酶,该酸性蛋白酶的最适作用温度为50°C，最适pH为3.5-4.7，pH超过6时酶活力迅速丧失。D.Wang等从米曲霉中分离到一种高耐盐性的中性蛋白酶，并对其酶学性质和动力学特性进行来研究。以特定的底物为目标，研究蛋白酶的催化性能可以从侧面米曲霉的发酵性能。张青等研究了在不同底物浓度、温度和pH条件下米曲霉蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的动力学特性。杨远帆等利用米曲霉能分泌多种蛋白酶的特性，研究该菌培养液水解鱼粉的动力学。除了蛋白酶和淀粉酶的研究，对纤维素酶,脂肪酶等也进行了研究。鲁梅芳等研究了曲种纤维素酶活力与酱油成分的相关性，结果表明提高酱油生产菌株的纤维素酶活力，可有效的提高发酵酱油的质量，提高原料利用率及出油率。

目前国内对米曲霉蛋白酶的动力学研究报道较少，而动力学研究是了解酶性质的重要方面，因此开展这类研究意义重大。2

应用酸性蛋白酶是烘焙、酒类、皮革等工业的重要用酶。其中，皮革工业主要是利用酸性蛋白酶改变蛋白的内部结构，达到物质间的分离，从而脱毛和软化，这样不仅可以提高效率，还可以改善其工作条件；另外，蚕丝的脱胶，肉类的嫩化，酒类的澄清等工作上也能够使用蛋白酶来达到效果；在医学上有治疗消化不良的胃蛋白酶，治疗支气管炎的酸性蛋白酶等医疗用酶。

中性蛋白酶应用于蛋白水解粉、烘烤行业、大豆分离蛋白、啤酒工业、医药、纺织等重要领域。在食品行业中，中性蛋白酶主要是用于食品营养强化剂并生产一些附加值较高的食品，主要原因是它可以将大分子蛋白质分解成小分子的肽或氨基酸，以利于人体的吸收和利用，小分子的肽和氨基酸类形成食品的风味，提高了产品的品质。面团中添加中性蛋白酶，由于大分子物质水解成小分子物质，其面团筋力减小，使其有较强的可塑性，在工艺上发挥了巨大的作用。在酒类生产的原料大麦、大豆等植物性蛋白中添加中性蛋白酶，可排除蛋白质产生的"冷混浊"现象，起澄清作用；在医药方面，含中性蛋白酶的药物，可起到消炎、利胆、止痛、助消化的功效。在纺织生产过程中，中性蛋白酶主要用于皮毛的软化和脱毛，羊毛等皮毛用中性蛋白酶处理后，其抗张度较强，使得毛线手感柔软，收缩性为0；利用中性蛋白酶制成的脱毛剂，皮革脱毛干净、光亮、无损伤。另外，中性蛋白酶还可用于饲料，在饲料中添加中性蛋白酶，有利于提高蛋白质的利用率和降低饲养成本。

碱性蛋白酶的主要应用领域：洗涤剂、制革、丝绸、饲料、医药、食品、环保，其应用主要围绕其水解蛋白质肽键的功能展开，生产生活中，有几个主要的需求：1. 使复杂的大分子蛋白质结构变成简单的小分子肽链或者氨基酸，从而变得易于吸收或洗去，比如食品、洗涤剂、饲料等领域。其中最常见的是加酶洗衣粉，它是洗涤剂中的新产品，其碱性蛋白酶的添加能去除衣物上的血渍和蛋白污物；2. 部分破坏蛋白质结构，使物质组分之间实现分离，这在皮革、丝绸等含蛋白质丰富的材料加工时十分有效；3. 促进环境污染物降解，用于环保领域；4. 蛋白酶既能催化水解反应，也能催化其逆反应，而且具备高度的活性和专一性，非常适合医药工业对某些特定分子的生产需求，如弹性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶。

氨肽酶应用比较广泛，主要是利用氨肽酶进一步水解蛋白质的酶解液达到脱苦的目的，其中包括亮氨酰氨肽酶、脯氨肽酶，因为肽链末端氨基酸残基除去后，其三维结构会发生显著改变，对酶解的敏感性增强；刘通讯通过研究发现，用氨肽酶进行二次水解所产生的多肽含量比单一用蛋白酶水解得到的多肽含量能提高将就一成。

羧肽酶主要应用于医药、食品中，如前列腺癌的治疗；高 F 值寡肽的制备；并用于羧肽酶常与氨肽酶、内肽酶共同作用，应用于食品风味加工，脱苦。1