[科普中国]-微生物分离技术

定义

根据微生物的特性和生长特点，模拟微生物的生态环境以不同的培养基和培养条件对微生物进行分离、纯化的过程。目前自然界中只有极少部分微生物能够得到分离与培养，严重阻碍了对微生物生命活动规律的研究和微生物资源的开发。改进传统的分离与培养方法，采用新型分离与培养技术，提高微生物可培养性，大量培养自然界中存在的微生物，从而更全面、准确地了解微生物细胞的生命规律、获悉微生物群落中各种微生物之间的动态相互作用和相互协调的规律，对环境微生物工艺进行准确地设计、精细地调控和高效地利用。

传统的微生物分离与培养方法与技术微生物平板培养方法：微生物平板培养方法是一种传统的实验方法。这种方法主要使用不同营养成分的固体培养基对土壤中可培养的微生物进行分离培养，然后根据微生物的菌落形态及其菌落数来计测微生物的数量及其类型。平板稀释法是进行土壤微生物分离培养的常用方法，一般分为稀释→接种→培养→计数等几个步骤。然而，这种方法也存在不少缺陷，主要表现在固体培养基的选择和实验室培养条件等方面的限制上1。

新方法与新技术在微生物分离与培养中的应用微生物难分离和培养的原因对微生物进行常规培养时，由于生活条件的改变，有些微生物不能适应而死亡，另一些则通过产生孢子进入休眠状态或改变细胞形态、进入维持一定代谢活性但不生长繁殖的“活的非可培养态”，结果均表现为微生物的“不可培养性”23。

（1）采用高浓度的营养基质：最初对微生物的培养是在富含营养的培养基中进行的，但是由于自然界中微生物数量庞大，其可利用的营养物质极度匮乏，多数处于“岔营养”状态。常规纯培养对这种认识不充分，通常将寡营养微生物迅速置于富营养状态，微生物初期的快速生长会产生大量的、微生物自身难以调节的过氧化物、超氧化物和羟基自由基等“毒性氧物质”，该类物质快速、过量的积累会破坏细胞内膜结构导致细胞死亡，从而表现出微生物的不可培养性。

（2）实验室中无法完全模拟自然界的环境条件：由于目前监测技术和手段的限制，人们对微生物生存环境和自然条件了解尚不充分。因此，人们没有或无法完全模拟微生物的自然生存条件，而通常将培养条件进行简化，将微生物置于恒温、恒湿、黑暗等环境中；将微生物限制在“板结”的琼脂或不扰动的液体介质中；简化微生物的营养组成没有提供微生物生长繁殖所必需的某些化学物质，等等。所以在自然界中可以生长繁殖的微生物，在“纯培养”中生长条件得不到满足，从而导致了微生物的不可培养性。

（3）环境微生物之间的相互关系被忽略：微生物相互关系繁多复杂，包括：种间的偏利共生关系和互惠共生关系，两者的共性是至少一个群体提供另一些群体所需的生长因子而使微生物群体获利；群体感应，这种关系被认为是通过细菌间的信息交流来调控细菌的群体行为：细胞通过感应一种胞外低分子量的信号分子来判断菌群密度和周围环境的变化，从而调节相应的细菌表达以调节细菌的群体行为。以上这两种关系都是微生物生长所必需的。

（4）生长缓慢的微生物被忽视：环境中很多微生物都聚集生长，当将这些微生物接种至培养基时，适合生长的微生物由于生长快而占据优势地位，它们对营养成分的大量摄取使生长缓慢的微生物得不到充足营养而生长受到抑制。

改进微生物分离与培养的措施（1）减少毒性氧物质的毒害作用：由于常规培养方法使用的高浓度营养基质不利于微生物生长，适当降低营养基质的浓度可以减弱这种不利影响。发现低浓度基质的培养基培养出的细菌在数量和种类上均多于高浓度基质的培养基，但营养浓度过低时会使培养出的微生物数量反而下降。

（2）维持微生物间的相互作用：在培养基中加入微生物相互作用的信号分子就可简单模拟微生物间的相互作用，满足微生物生长繁殖的要求。

（3）供应新型的电子供体和受体：不同微生物的代谢过程不同，因此对反应的底物要求也不尽相同。供应微生物需要的特有底物有助于新陈代谢反应的进行及微生物的正常生长。大量的研究表明，将新颖的电子供体和受体应用到微生物培养中，能够发现未知的生理型微生物。

（4）分散微生物细胞：自然界中很多微生物聚集生长，形成“絮体”和“颗粒”等，致使其内部的微生物不易被培养。对“絮体”和“颗粒”进行适度的超声处理，将细胞分散再进行培养，可以使更多的微生物接触培养基而得到培养。

（5）延长培养时间：对“寡营养菌”的培养，可适当延长培养时间，使其能长至肉眼可见的尺度。当然培养时间不能无限增长，因为培养时间越长，对培养环境的无菌要求就越高4。

（6）利用琼脂替代物：琼脂对某些微生物具有毒性作用，采用无害且凝结作用较好的替代物质作为培养基固化剂，可以增加微生物的可培养性。

开发新型分离与培养技术稀释培养法和高通量培养法在地球环境中，海洋环境中迄今可培养微生物的比例最低，仅为0.001%-0.1%，这是由于海洋环境中主要是寡营养微生物，它们在人工培养时往往受到少数优势生长的微生物的竞争作用而不能生长。

扩散盒培养法Kaeberlei等在分离培养潮间带底泥中的微生物时使用一种新颖的自制培养仪器，为其起名为扩散盒。扩散盒由一个环状的不锈钢垫圈和两侧胶连的0.11μm滤膜组成，滤膜只能允许培养环境中的化学物质通过而不能让细胞通过。

细胞包囊法Zengler等将海水和土壤样品中的微生物先进行类似稀释培养法的稀释过程，然后乳化，部分微生物形成了仅含单个细胞的胶状微滴。然后将胶状微滴装入层析柱内，使培养液连续通过层析柱进行流态培养。层析柱进口端用0.11μm滤膜封住，防止细菌的进入而污染层析柱;出口端用8μm滤膜封住，允许培养产生的细胞随培养液流出。该方法的特点是让微生物在开放式培养液中生长，使培养环境接近于微生物的自然生长环境，能够很好地提高微生物可培养性，但成本较高，不利于普及使用。

序列引导分离技术序列引导分离技术是根据微生物基因组中特定基因的特异性序列，设计引物或杂交探针，以培养物中目标序列存在和变化情况为标准，来指导对微生物最优培养条件的选择，培养出新的微生物。