[科普中国]-凝胶色谱净化

凝胶色谱是以多孔凝胶为固定相，利用凝胶孔的空间尺寸效应，使不同大小的分子达到分离的一种高效液相色谱（HPLC）方法。其分离机理类似于分子筛效应，大体积分子只能渗入少量大孔，在固定相中所经历的路径较短，先流出。所有孔隙都不能进入的大体积分子，不被保留，在死体积处流出。因此，溶质按分子体积从大到小依次流出色谱柱。在凝胶色谱中，流动相只起溶解样品的作用，以有机溶剂为流动相的凝胶渗透色谱（GPC）应用较多，而以水为流动相的凝胶过滤色谱（GFC）的应用相对较少，这主要是因为水溶性大分子不仅可以溶于水，通常也能溶于有机溶剂中。四氢呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等非极性有机溶剂是最常用的流动相。在凝胶色谱中，固定相表面与溶质分子间不存在化学相互作用，即固定相是惰性多孔材料。目前凝胶色谱固定相主要使用半硬质凝胶（如聚苯乙烯凝胶）和硬质凝胶（如多孔硅胶和多孔玻璃珠）。软质凝胶（如葡聚糖）因不耐压，通常只用于低压凝胶色谱。凝胶色谱主要用于高分子化合物的分子量及其分布的测定、中小分子有机物的分离与定量分析、生物大分子纯化（制备凝胶色谱）、凝胶色谱指纹图谱（如原油及其重质组分的评价）和样品净化。凝胶渗透色谱（GPC）用于样品净化的主要目的是为后续分析除去干扰物质（如大分子基体物质）或对样品进行浓缩。目前， GPC净化所用凝胶柱尺寸比用于GPC分析的要大。GPC样品净化采用的操作方式主要是为了分析生物样品中的小分子有机物而除去脂肪、蛋白质等大分子干扰物质；有时为了采用液质联用技术（HPLC-MS）等技术分析生物大分子，也可采用GPC除去样品中的小分子或脱盐。GPC除去大分子物质选择的固定相的孔径应该比较小，大分子难以进入孔道内，快速流出凝胶柱；而目标小分子可以进入孔道，在大分子物质之后流出，从而实现分离2。

凝胶色谱净化的发展过程凝胶色谱作为一种分离技术最早出现在1959年，porath和flodni用交联的缩聚葡糖制成凝胶，成功分离了水溶液中不同分子量的化合物。随后凝胶色谱技术在生物化学研究领域中迅速推广应用，成为生物化学研究中一种常用的分离手段。1964年moore用苯乙烯和二乙烯苯在不同条件下制成了一系列不同孔径的凝胶，这类凝胶可以在有机溶剂体系中使用，因此扩大了凝胶色谱的使用范围，使这种技术广泛应用于高分子科学领域，是一种快速有效的测定分子量和分子量分布的方法。60年代末，凝胶渗透色谱技术开始用于农药残留分析并初步实现了自动化。随后，这项技术受到广泛重视并在各个研究领域都取得了较好的研究结果，成为一个非常活跃的研究领域。无论在凝胶的制备，仪器的技术性能、应用研究上都取得了很大的进展，应用范围也涉及到生物化学、高分子化学、有机和无机化学等众多领域。

凝胶的种类及应用凝胶是凝胶色谱的核心，是对组分进行分离的基础。已经研制和使用过的凝胶很多，制备工艺、使用技术和条件也各有不同。根据凝胶材料的来源可以分为有机凝胶和无机凝胶；根据制备方法可以分为均匀、半均匀和非均匀三种；根据凝胶使用的强度性质分为软胶、半硬胶和硬胶三类；根据使用的溶剂范围可以分为亲水性、亲油性和两性凝胶。亲水性凝胶主要用于生物化学研究中对蛋白质、酶等进行分离和分析，亲油性凝胶应用于合成的高分子材料和有机体系中化合物的分离和分析。选择和使用不同性能不同孔径的凝胶决定了分离净化的效果，通常可根据样品基质类型和待分离组分的分子大小决定所选择的凝胶的种类。

凝胶色谱仪凝胶色谱分析柱性能稳定并且在固定的淋洗系统中可以重复使用，使凝胶色谱技术具有实现自动化的基本条件。凝胶色谱仪主要由输液系统（包括溶剂贮存器、脱气装置、输液泵、进样器等）、色谱柱、检测器、信号记录仪、控制系统等部分组成。1965年waters公司的GPC 2000型凝胶色谱仪问世，随后陆续出现各种类型的自动化凝胶色谱仪，但这些仪器主要用于分子量和分子量分布的测量。在相同色谱条件下，农药和杂质的洗脱体积能够保持相对的恒定，使得凝胶色谱净化技术（尤其是自动化凝胶色谱技术）在农药残留分析中的应用日趋广泛。

凝胶色谱法与其他净化方法联用技术基质比较复杂或者含有杂质较多的样本（如含有大量的油脂，色素，生物碱等），经过凝胶色谱净化虽然可以除去大部分大分子杂质，但是，与农药分子大小相近的杂质却无法去除，对剩余的这一部分杂质需要使用其它净化技术进一步挣化，以防止杂质污染进样口或柱头，或者杂质占据分析系统中的活性点，导致色谱分离能力降低、干扰严重，仪器灵敏度降低，或产生基质增强效应等。

凝胶色谱法和吸附色谱法或其他净化技术联用，可以达到彻底净化样本杂质的目的。其中，固相萃取技术是常用的样品净化技术之一，根据分析物和杂质在固定相上吸附和解吸附的行为不同分离目标物与杂质，实现对样品的净化。目前，以这两种净化方法联用为主，其联用形式主要有离线联用和在线联用两种。较为常用的是离线凝胶色谱一固相萃取联用技术。样品经凝胶色谱净化，收集所需组分并浓缩，再根据化合物和剩余杂质的类型和性质，采用固相萃取技术，使用不同性质的固相萃取吸附剂进一步净化。Ueno-E等采用GPC和Florisil联用净化技术，分析了多种蔬菜和水果中多种农药残留；Furusawa N等采用该方法分析了鸡蛋中有机氯农药残留；Ueno-E等人采用GCP与活性碳色谱及Florisil联用，建立了农药多残留分析方法并实际检测了203个农产品中的农药留；Pantiru-M等人研究了各类固相萃取柱与GPC联用，分析了蔬菜、水果和谷物中15种氨基甲酸酷和15种酸性农药残留阅。可见，目前离线GPA-SPE技术在农药残留分析前处理中应用和研究较多3。