[科普中国]-菌种保藏

目的

微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，保持菌株优良性状不退化，保持优良菌株存活，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。2

原理菌种保藏有多种方法，其原理大多大同小异，主要是运用一些方式尽量降低生物体内的代谢，达到延长生命，减少变异的目的。通常采用的方法为低温、缺氧、干燥。

低温主要对菌种产生两方面的影响，首先，较低的温度可以减缓机体细胞的酶活，降低新陈代谢，达到保藏菌种的目的。其次，低温同时会导致菌体诱发菌丝自溶机制，如果降温过程失误，同样会造成机体的机械损伤和溶质损伤。

微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。

低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。3

实验器材
细菌、酵母菌，放线菌和霉菌。
肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95%酒精，10%盐酸，无水氯化钙。
灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与 100目筛子，油纸，滤纸条（0.5×1.2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。

具体方法传代培养保藏法包括又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等，培养后于4-6℃冰箱内保存。

其中斜面培养法是将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2-8℃的冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2-4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。

此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状，污染杂菌的机会亦较多。

液体石蜡覆盖保藏法
液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与空气隔绝，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还防止水分蒸发，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求在-4-4℃下，液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。

具体的操作方法：

1、将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1.05kg/cm，121℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。

2、将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。

3、用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准，使菌种与空气隔绝。
4、将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。
此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1-2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。

载体保藏法载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。

（一）沙土保藏法

1、取河沙加入10%稀盐酸，加热煮沸30分钟，以去除其中的有机质。

2、倒去酸水，用自来水冲洗至中性。

3、烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。

4、另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。

5、烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。

（二）滤纸保藏法

1、将滤纸剪成0.5×1.2cm的小条，装入0.6×8cm的安瓿管中，每管1-2张，塞以棉塞，1.05 kg/cm，121℃灭菌30分钟。

2、将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。

3、取灭菌脱脂牛乳1-2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。

4、用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。

5、将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。

6、将棉花塞入管内，用火焰按图Ⅶ-13熔封，保存于低温下。

7、需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。

细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14-17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。

寄主保藏法
寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法，其中最常见的是甘油管冷冻保藏法。

甘油管冷冻保藏法是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。其方法是将80%的甘油高压蒸汽灭菌待用。将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液。取1ml灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘油浓度约为10%-30%，于-70℃下冻存。-20℃保存时间较短。或采用体积比为8：2的甘油-生理盐水，加入新鲜培养的菌体肉汤，混合均匀后至-20℃冰箱保存。

该方法适用于一般细菌的保存，同时也适用于链球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种，适用范围广，操作简便，效果好，无变异现象发生。甘油-生理盐水保存液保存菌种优于甘油原液，其原因可能是加入生理盐水适当降低了甘油的高渗作用，且有肉汤培养物适量增加保存液的营养成分，从而更好地保护了待保存的菌株。

冷冻干燥保藏法
先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥），其中真空冷冻干燥法最常见。

真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%。真空冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用保护剂来制备细胞悬液，使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质，通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。即是使样品中的水分在冰冻状态下，抽真空减压，使冻结的冰直接升华为水蒸气，使样品达到干燥。干燥后的微生物在真空下封装，与空气隔绝，达到长期保藏的目的。4

注意事项无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。

影响因素菌的质量保藏的菌种应培养在营养丰富的最适条件下，使之进入稳定期，稍老一些的菌体对环境抵抗力强。另处，作为冷冻干燥的菌悬液细胞浓度要高不同的菌对冷冻干燥的耐受程度不同，如果保存的菌液细胞浓度不高，就会使以后传种造成困难，保存期也会受到影响。

保护剂不同种类的保护剂对不同微生物的作用是不同的，如个别菌种在脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达99.99%，而采用葡聚糖等混和保护剂时死亡率大大减少。一般情况下，那些容易保存的菌种对保护剂的要求不很严格，而不易保存的菌种对保护剂的要求却很苛刻。因此，选择好的保护剂是冷冻干燥保存菌种的关键因素。

干燥速度实验表明，慢速干燥比快速干燥存活率高，如青霉菌6h干燥存活率为67.3%，而3h为59%。

空气的影响冷冻干燥后空气对细菌细胞影响较大，可导致细胞损伤进而死亡，故在冻干后应立即在真空下融封，才有利于长期保存。

温度的影响在干燥和真空状况下温度的影响远没有上述几项因素重要，因此可以在室温下保存，但许多微生物在4℃保存的存活率要比在室温下高1倍。

含水量的影响水分含量过高对菌存活不利，完全脱水也不利于保存，一般把干燥后的细胞含水量控制在3%以下(1%-3%)。5

机构菌种保藏可按微生物各分支学科的专业性质分为普通﹑工业﹑农业﹑医学﹑兽医﹑抗生素等保藏管理中心。此外﹐也可按微生物类群进行分工﹐如沙门氏菌﹑弧菌﹑根瘤菌﹑乳酸杆菌﹑放线菌﹑酵母菌﹑丝状真菌﹑藻类等保藏中心。

目前﹐世界上约有 550个菌种保藏机构。其中著名的有美国典型菌种保藏中心(简称ATCC﹐马里兰)﹕1925年建立﹐是世界上最大的﹑保存微生物种类和数量最多的机构﹐保存病毒﹑衣原体﹑细菌﹑放线菌﹑酵母菌﹑真菌﹑藻类﹑原生动物等约 29000株﹐都是典型株﹔荷兰真菌菌种保藏中心(简称CBS﹐得福特):1904年建立﹐保存酵母菌﹑丝状真菌约 8400种﹑18000株﹐大多是模式株﹔英国全国菌种保藏中心(简称NCTC﹐伦敦)﹕保存医用和兽医用病原微生物约2740株﹔英联邦真菌研究所(简称CMI﹐萨里郡)﹕保存真菌模式株﹑生理生化和有机合成等菌种2763种﹐8000株﹔日本大阪发酵研究所(简称IFO﹐大阪):保存普通和工业微生物菌种约9000株﹔美国农业部北方利用研究开发部(北方地区研究室﹐简称NRRL﹐伊利诺伊州皮契里亚)﹕收藏农业﹑工业﹑微生物分类学所涉及的菌种﹐包括细菌5000株﹐丝状真菌1700株﹑酵母菌6000株。

1970年 8月在墨西哥城举行的第10届国际微生物学代表大会上成立了世界菌种保藏联合会(简称WFCC)﹐同时确定澳大利亚昆士兰大学微生物系为世界资料中心。这个中心用电子计算机储存全世界各菌种保藏机构的有关情报和资料﹐1972年出版《世界菌种保藏名录》。

中国于1979年成立了中国微生物菌种保藏管理委员会(简称CCCCM﹐北京)。6