[科普中国]-适配体

核酸适配体简介

SELEX 技术是20世纪90年代初新兴并发展的一种体外指数富集配体的系统进化的组合化学技术，能够有效地用于核酸结构分析与功能研究。核酸适配体(aptamer)是基于SELEX 技术从随机寡核苷酸文库中筛选获得的对靶物质具有很高特异性与亲和力的寡核苷酸序列。人工化学合成一个文库容量为1014-1015的随机寡核苷酸文库，其总长度一般为70-100 nt，中间包含20-40 nt的随机序列。文库与靶标物质孵育一定时间后形成核酸-靶标的复合物，利用一定的方法除去未与靶标结合的文库序列，复合物热解离获得与靶标结合的序列，并以此为模板进行 PCR 扩增，进而制备下一级文库。经过8-20轮不断筛选获得对靶标具有高特异性与高亲和力的寡核苷酸序列，即适配体。适配体经克隆测序后获得相应核酸序列用于后续的研究

适配体的筛选方法适配体靶标范围广，靶标的大小与可溶性均不同，因此应用 SELEX 技术筛选核酸适配体可以采用不同的具体操作方法。离心沉淀法常用于针对细胞、细菌与病毒的适配体筛选，固相吸附与洗脱技术可以用于可溶性小分子的适配体筛选。适配体筛选的具体方法包括以下几个方面。

基于不同固定介质的筛选方法。硝酸纤维素膜过滤法是一种常用于蛋白质适配体筛选的方法。Joshi 等基于硝酸纤维素膜设计了一种横向流动色谱装置，结合应用该装置与 SELEX 筛选技术，作者经过7轮正筛和3轮反筛获得了针对鼠伤寒沙门氏菌外膜蛋白(Omp)的高亲和力适配体33和45序列，检出限为10-40 cfu/mL。凝胶柱亦是适配体筛选常见的固定介质。Tang等基于琼脂糖凝胶树脂应用SELEX 技术筛选获得对红豆毒素具有高特异性与高亲和力的适配体，其解离常数低至几nmoL范围。近些年来，以微孔板为固定介质筛选适配体应用广泛。王立峰等基于微孔板技术筛选获得能与癌胚抗原(CEA)特异性结合的高亲和力适配体序列，研究表明该适配体在肿瘤早期诊断、监测与治疗方面具有重要作用。

荧光磁珠 SELEX(FluMag-SELEX)技术。FluMag-SELEX 是结合应用磁珠与 SELEX技术筛选荧光适配体的一种方法，该方法需要靶标量少且可通过荧光直观测定结合适配体的量。Kim 等应用FluMag-SELEX 技术筛选获得广谱抗炎性药物布洛芬的5条特异性适配体。其中三条是外消旋布洛芬的特异性适配体，另外两条能与外消旋和内消旋布洛芬特异性作用。布洛芬适配体的特异性强，与布洛芬类似物、土霉素均没有结合作用。Xu等应用 FluMag-SELEX 技术筛选获得多氯联苯的特异性适配体，其解离常数为微摩尔级别，且在 0.1 到 100 ng/mL 范围内线性良好。

毛细管电泳SELEX 技术(CE-SELEX)。不同组分间的荷质比存在一定差异，导致物质的电泳迁移率有所不同，从而实现不同组分的分离。CE-SELEX 能在2-4轮内实现高亲和力适配体的筛选，常被用于筛选蛋白质、脂多糖、多肽等大分子物质。Yang等首次利用 CE-SELEX 实现了对小分子物质甲基吗啉的适配体的筛选，经过3轮筛选后获得了8条高亲和力适配体，其解离常数为到几百nM 到几uM，其中两条序列能够催化中卟啉的金属插入反应，催化强度分别为1.7倍和2倍。针对亲和力较弱的适配体与靶标体系存在动态解离平衡这一问题，科研工作者发展了平衡混合物的非平衡毛细管电泳(NECEEM)、平衡混合物的平衡毛细管电泳(ECEEM)和 Non-SELEX 毛细管电泳技术。Ashley 等应用 Non-SELEX 技术筛选获得过氧化氢酶的适配体，作者应用荧光分光广度计与毛细管亲和力电泳表征了其亲和力与特异性，结果显示适配体对靶标的亲和力比与其他四种蛋白的亲和力高至100倍，也显示了其高特异性。该适配体可应用于生物传感器、免疫印迹与生物标志物鉴定。Ashley 等又基于 NECEEM 和 SELEX 技术筛选获得在自由的三维空间环境的人类瘦素蛋白的适配体，其解离常数为几百 nM。

细胞 SELEX(Cell-SELEX)技术。该方法的主要靶标物质是细胞、细菌或病毒等，操作过程中采用离心、沉淀的方法分离去除未结合适配体，再通过热解离或酶切作用获得特异性适配体序列。Liang 等针对感染狂犬病毒的活细胞，应用 Cell-SELEX 经过35 轮重复筛选获得了 5 条 DNA 适配体。病毒效价测定与实时定量反转录 PCR 实验均表明筛选获得的 5 条适配体能够抑制狂犬病病毒的复制，为狂犬病感染的治疗提供了一种可能性。Ninomiya等应用 Cell-SELEX 经过 11 轮重复筛选，获得12条与人类肝癌细胞HepG2 特异性结合的高亲和力适配体，其解离常数范围为19-450 nM。作者分析获得 12 条适配体共有的二级结构，这与 HepG2识别密切相关。该方法可以在靶标性质不明确、结合位点未确定的情况下进行筛选，并且无需制备靶标的复杂过程。

适配体的优点自20世纪90 年代适配体的概念被提出以来，科研工作者不断致力于适配体的研究，发现适配体具有许多优点。首先，相比较传统微生物培养，检测周期短、检测限低且具有高亲和力与强特异性，这源于适配体具有较大表面积和大量受体结合位点且空间三维构型易形成螺旋、发卡、茎环、凸环、三叶草和假结等结构，能够与靶标物质基于范德华力、氢键和疏水作用等紧密结合，并可以区分结构类似物质；其次，相比较抗体检测，筛选获得的适配体易于体外大量合成，重复性好、稳定性高且易于贮存；再次，相比较分子生物学，操作简便易行，检测成本较低；同时，适配体靶标广泛，包括农药、组织、细胞、病毒、蛋白质、毒素、维生素和过敏原等；适配体易于标记荧光且活性不受影响，因此易于结合应用其他检测技术1。

适配体的应用1990 年，Tuerk与Ellingtong基于 SELEX 技术率先分别筛选获得了噬菌体T4DNA聚合酶与有机染料的特异性RNA适配体。自此以来，适配体已经被广泛应用于细胞成像、新药研发、疾病治疗与微生物检测等众多方面。

细胞成像：荧光标记适配体或适配体复合物是适配体应用于细胞成像的基础。流式细胞仪、荧光分光光度计常被用于测定荧光标记适配体与靶细胞结合力的大小，荧光显微镜能够呈现复合物的直观图像。Wang 等基于FISH技术和荧光标记的特异性DNA 适配体构建了绿脓假单胞菌的成像检测系统。荧光适配体探针还可以用于细胞内部的显微成像。Valencia 等基于核糖核酸结合蛋白质及其适配体间的相互作用，实现了大肠杆菌活细胞内细菌 RNA 的成像工作。

药物传送：科研工作者已经研发了多种抗癌药物，纳米材料也广泛应用于药物的传送，但其具有生物相容性差、不能定向传送且对其他细胞伤害大的缺点。适配体能够与靶标特异性结合，纳米材料-特异性适配体复合物能够实现药物在细胞内的定向传递。Chang 等构建了一种五角星构型的纳米材料二十面体，其与特异性适配体 DNA 结合后可以携载阿霉素，定向传送到病灶位置，特异性导致上皮癌细胞死亡。J

疾病治疗：研究发现 MCF7 附膜抗原蛋白的特异性适配体能够通过生物素-链霉亲和素反应与补体组分1(C1q)结合，显著诱导癌细胞膜的渗透压膨胀甚至细胞死亡，对于乳癌的治疗具有一定作用。适配体的动力学性质与促凋零作用表明 GSH-RNA 适配体是一种潜在的抗癌化学治疗剂。

微生物检测：食源性致病菌的检测是科学工作者研究的重要课题，目前适配体已经广泛地应用于致病菌的检测。Joshi等应用 SELEX 技术，筛选获得了鼠伤寒沙门氏菌的两条适配体，其检测下限可达10-40 cfu/g，实现了环境与食品中鼠伤寒沙门氏菌的快速灵敏检测2。