[科普中国]-布鲁氏菌属

布鲁氏菌属的病原学

革兰氏染色阴性，不运动，好氧性，仅可利用少量的碳水化合物，而不形成酸。可在肝浸出物等动物性培养基中生长，产生大量氨和硫化氢。最显著的特征是培养中需要二氧化碳，在10%的CO2中能进行良好的发育。所产生的毒素和痢疾菌等肠道细菌相类似，被提纯的一种菌体抗原是糖脂-糖肽复合体，是由磷脂、甲酰胺和氨基酸组成。具有两种凝集抗原，即特异的M抗原（布鲁氏菌病）和A抗原（流产），不同种之间其含量具有明显的差异。在培养过程中易发生S－R相变异（可能是由于积聚了不能被利用的丙氨酸的作用），致丧失致病力，而凝集反应也完全改变。其寄生在雌体生殖器官或乳腺内，可常常引起流产。该菌还可侵袭血液或网状内皮系统，但症状多不固定。典型种是马耳他热布鲁氏菌（Brucella melitensis），牛流产布鲁氏菌（B．abortus）、猪布鲁氏病菌（B．suis）。这属菌在抗原性等方面表现出与肠道细菌及巴斯德氏杆菌等有亲缘关系1。

布鲁氏菌属的危害性布鲁氏菌病是一种广泛分布的人兽共患慢性传染病。布鲁氏菌可感染人类、多种家畜和野生动物，引起相似的临床症状与病理变化，如发热、流产与不育、慢性关节炎及神经损害等，导致巨大的经济损失和严重的公共卫生问题。家畜布鲁氏菌病最常发生于羊、牛、猪。传统上根据布鲁氏菌宿主特异性和危害性，具有重要公共卫生意义的种类有：马耳他布鲁氏菌(羊种)，主要感染和危害的宿主广泛，包括人、羊、牛及多种野生动物；流产布鲁氏菌(牛种)，主要感染和危害牛；猪种布鲁氏菌主要感染猪；绵羊副睾种布鲁氏菌，主要感染危害羊；犬种布鲁氏菌主要感染和危害犬。不同种类布鲁氏菌大多具有交叉感染能力。人和羊对马耳他布鲁氏菌高度易感，造成的危害严重。猪种布鲁氏菌对猪和人均表现出高度易感性，危害也较为严重，对牛尽管能建立感染，但几乎不形成危害。布鲁氏菌的侵入感染可经呼吸、消化、生殖系统粘膜以及损伤甚至未损伤完整皮肤等多种途径，通过接触或食入感染动物的分泌物、体液、尸体、污染肉品、乳汁、乳酪等建立感染。人类感染布鲁氏菌后一般不发生水平传播。家畜，特别是对马耳他布鲁氏菌最为易感的绵羊、山羊和牛，是人类最主要的感染源。布鲁氏菌病缺乏有效的治疗手段，特别是慢性布鲁氏菌病菌，采用现有抗菌药物大剂量、长时间的治疗收效有限。布鲁氏菌病在我国曾经是危害极为严重的人兽共患传染病。解放后，布鲁氏菌病防治受到高度重视，被列为二类法定传染病而得到有效控制，取得了世人瞩目的成就。90 年代后期本病疫情有所回升，我国布鲁氏菌病防治工作仍面临长期而艰巨的任务。

布鲁氏菌属的PCR检测长期以来，国内外学者对布鲁氏菌病及其病原进行了深入细致的研究，其中对布鲁氏菌病诊断技术的研究是比较活跃的领域。最初的细菌培养法可以直接检查到布鲁氏菌，而得出确定的诊断结论，是建立诊断的“金标准”，但布鲁氏菌的培养常要几天甚至几周时间，操作活菌的危险性，慢性布鲁氏菌病阳性率偏低，生物学特性鉴定以及随后的布鲁氏菌种或菌株的鉴别则更加复杂，要由技术熟练的专家才能完成，既耗时又费力。随着免疫学技术的不断成熟和发展，出现了血清凝集反应、免疫电泳、补体结合试验、反向间接血凝、酶联免疫及放射免疫分析等诊断方法。但是这些方法不能严格区分疫苗免疫和强毒自然感染诱导的血清学反应，易出现假阳性和假阴性，使之应用受到限制。随着分子生物学的发展，采用PCR技术检测布鲁氏菌病的方法成为可能，它不同于传统的表型诊断，而是检测布鲁氏菌的核酸而达到特异、敏感检测的目的。自从1990年Fekete等首次报道 PCR 检测布鲁氏菌病方法以来，运用 PCR 技术进行布鲁氏菌病分子生物学诊断的研究取得了较大的进展。

最早检测布氏鲁氏菌的PCR实验集中于该属细菌的鉴别。1990年Fekete等首次报道了用 PCR方法检测布鲁氏菌的方法，扩增产物635bp，该序列是编码牛种布鲁氏菌 S19 的 43KDa 外膜蛋白基因的一部分，该方法对布鲁氏菌属是特异的，适于布鲁氏菌属所有种和生物型，非常敏感（低于100个细菌），由于专利的原因，作者没有公布引物和靶序列的相关内容，因此这个实验从未被其他实验室重复过。1992 年Herman 等研究牛种布菌 16SrRNA 基因，实验选择了与布鲁氏菌存在血清学交叉反应的细菌作为对照菌，如大肠杆菌 O:157、佛朗西斯土拉杆菌 H:7、出血败血性巴氏杆菌、厄班那沙门氏菌、小肠耶尔森菌 O：9和在种属关系上与布鲁氏菌较近的 11 种细菌，其中包括放射形土壤杆菌、发肿草原菌、深红红螺菌等。最初，与布鲁氏菌种系关系最近的深红红螺菌曾发生交叉反应，Herman通过提高复性温度消除了交叉反应，成功地扩增了牛种布鲁氏菌和其他种布鲁氏菌的 800bp 的片段，实验证明目的序列高度保守，可用于布鲁氏菌属的检测。其后，检测布鲁氏菌属的试验采用了 rRNA 操纵基因，1995 年Romero 等分析了 9 个不同引物组合的 PCR 实验结果，与 Herman的结果相似，试验能检测所有布鲁氏菌菌株，但有部分深红红螺菌存在假阳性结果。随后，Rijpens 等以 16S-23S 基因间隔序列设计了PCR实验，检验了9株深红红螺菌和47株其他菌，扩增在50℃复性时，有的深红红螺菌出现交叉反应，而以55℃复性就可消除交叉反应。虽然存在交叉反应，但应当指出的是，深红红螺菌的感染是少见和条件性的，且病情不易与布鲁氏菌病相混淆。1992 年 Baily 等报道了以 BCSP31 基因为目的片段PCR检测实验。此前Mayfield等曾对该基因进行了克隆和测序，该基因在所有检验过的布鲁氏菌种和生物型中是保守的，编码一种未知功能的抗原蛋白。1988年Bricker等证实该基因在绵羊副睾种布鲁氏菌中不表达。Baily 等设计并选择了一对寡核苷酸引物，获得223bp的扩增产物，结果表明对于布鲁氏菌的牛种和羊种是稳定的、敏感和特异的。但没验证其他种布鲁氏菌和深红红螺菌。1996年Da Costa 等报道了更详细的研究结果，实验能鉴别所有布鲁氏菌的种和生物型，他们还检测了其他 98 种细菌，结果均为阴性。该实验曾被国内外多个学者重复过，证明对布鲁氏菌属是特异的、敏感的和可靠的方法。

布鲁氏菌属的致病机理布鲁氏菌主要通过呼吸道、消化道和皮肤黏膜感染宿主。布鲁氏菌进入宿主后与宿主巨噬细胞细胞膜上富含胆固醇和糖鞘酯的 lipid rafts 相互作用，布鲁氏菌与 lipid rafts 紧密关联在一起，与巨噬细胞细胞膜相互作用，进而促进巨噬细胞吞噬布鲁氏菌避免氧化杀伤，细胞膜内涵 lipid rafts，巨噬细胞吞噬的布鲁氏菌和布鲁氏菌存在于 membran-bound vacuole内涵体中，形成 BCV 吞噬小体。当布鲁氏菌进入巨噬细胞后立即利用早期胞内体途径形成酸化的间隔层并待在其中，BCV、早起内涵体与 Proton 三者相互作用，细胞内质子泵快速酸化吞噬小体形成 pH4-4.5 的早起吞噬小体，在早期感染阶段 90%多的感染布鲁氏菌被清除，存活下来的不到 10%的感染布鲁氏菌，这一时期为早起吞噬小体，在早起吞噬小体中只有 10%的布鲁氏菌存活下来与内质网相互作用形成复制吞噬小体，酸化的布鲁氏菌吞噬小体逃避溶酶体的消化，吞噬小体上的 lipid rafts 参与了吞噬小体与经典途径的隔离，这些复制性的吞噬小体通过促进 BCV 与宿主巨噬细胞中的内质网相互作用来形成。同时，巨噬细胞内的营养缺乏、酸化 pH、低氧等压力为布鲁氏菌提供了一个苛刻的环境，不同的压力条件，诸如营养缺乏、酸化、缺氧等激活了 DnaK 和相关分子伴侣的表达。在热休克和酸性 pH 值条件下，dnaK 的表达被诱导。复制性的吞噬小体作为布鲁氏菌胞内环境，溶酶体不能消化布鲁氏菌，同时感染时期正常的细胞运输不受影响。在复制性的吞噬小体中，布鲁氏菌开始合成和激活特定的毒力因子。布鲁氏菌在复制性的吞噬小体中开始快速复制2。