[科普中国]-磷酸酶

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磷酸酶可以被分为两类：碱性磷酸酶和酸性磷酸酶。

酸性磷酸酶酸性磷酸酶的基本性质与功能诱导并分泌酸性磷酸酶是植物应对低磷环境的重要适应性反应之一。酸性磷酸酶可以从不同的有机磷底物上水解磷酸基团，供植物吸收利用。大多数的植物酸性磷酸酶没有明显的底物特异性，可以水解的底物包括 RNA、DNA、3-磷酸甘油酸、磷酸己糖等。体外实验中，从拟南芥、番茄中纯化的酸性磷酸酶的酶活力都受到了缓冲液中高 Pi 浓度的抑制，进一步研究发现酸性磷酸酶水解产生的 Pi 可以负反馈抑制大多数酸性磷酸酶的活性。酸性磷酸酶也可以分解一些特殊的有机磷底物，产物可以显现特异的颜色，如 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate，BCIP，蓝色）、萘酯磷酸盐（β-NaphthylAcid Phosphate，β-NAP/Fast black K，紫红色）、对硝基酚磷酸二钠（p-NitrophenolPhosphate，pNPP，黄色）。通过反应产物颜色的深浅，可以判断酸性磷酸酶的活性高低。运用这一方法可以筛选对低磷胁迫反应异常的突变体。低磷诱导的酸性磷酸酶可以分为两类：作用于细胞内的酸性磷酸酶和分泌到细胞外的酸性磷酸酶。二者的共同作用保证了植物更好地应对低磷胁迫。细胞内的酸性磷酸酶可以通过两个途径实现体内磷的再循环：一是将植物液泡内的有机磷转化为 Pi。正常情况下，植物中大部分的磷储存在液泡中，细胞质中的 Pi 含量维持在一定范围内。当植物受到低磷胁迫时，植物体内的 Pi 含量不断下降，液泡中正常情况下被高磷环境抑制的酸性磷酸酶的酶活力恢复，水解液泡中储存的有机磷并通过液泡膜上的磷转运蛋白向细胞质分泌，维持细胞质中 Pi 含量的动态平衡。另一个实现体内磷循环的途径是将衰老的组织中的磷活化再利用转运到幼嫩组织。Robinson 等人报道了，拟南芥紫色酸性磷酸酶 AtPAP26 就参与了衰老组织中磷的再利用过程。分泌型的酸性磷酸酶的主要作用是分解土壤环境中的有机磷底物释放出可以供植物直接吸收利用的 Pi。通常情况下，分泌型的酸性磷酸酶比细胞内的酸性磷酸酶更加稳定。分泌型的酸性磷酸酶的 pH 活性范围（活性高于 50%）是 4.0-7.6，温度活性范围（活性高于 80%）是 22℃-48℃。这保证了它们能够更高效、更持续地在复杂的土壤介质中发挥作用。有报道称，土壤中植物可以直接吸收利用的 Pi，80%来源于分泌到胞外的酸性磷酸酶对土壤中有机磷底物的分解，足以见得酸性磷酸酶的重要性。

分泌型的酸性磷酸酶按照其最终发挥作用的位置又可分为释放到环境介质中的酸性磷酸酶和附着在根表面的酸性磷酸酶。分泌到介质中的酸性磷酸酶相对而言更易于研究，是因为可以通过悬浮细胞培养或者幼苗培养的方法，收集液体培养基中的分泌蛋白。通过生化的方法富集、分离、鉴定出不同的酸性磷酸酶，并进行相关的遗传和生理分析。近些年通过类似的研究方法，科学家们已经从多种不同的物种中鉴定得到了许多酸性磷酸酶，这些物种包括白羽扇豆、菜豆、烟草、以及拟南芥。但附着在根表面的酸性磷酸酶相对而言比较难于研究，因为很难得到大量的蛋白进行生化分析，目前只有遗传学的方法是最为有效的研究手段。附着在根表面的酸性磷酸酶可以被一种人工合成的有机磷底物BCIP特异性地检测出来。在拟南芥根表面，覆盖一层含有0.01% BCIP、0.5%琼脂的溶液，室温放置过夜后，可以看到拟南芥根的表面被染成蓝色，蓝色的深浅程度反映出拟南芥根表面酸性磷酸酶活性的高低。根表面BCIP染色的方法被广泛应用于与低磷响应相关的突变体的筛选中，比如：pup1、pup2和pup3突变体先后在1998年和2004年被报道，遗憾的是它们各自的突变基因没有被鉴定出来1。

酸性磷酸酶活性与有机磷的有效性磷饥饿条件下, 植物被诱导分泌酸性磷酸酶;另一方面, 植物根系分泌酸性磷酸酶活性的增加又能够水解释放土壤中的有机磷化合物供植物生长。在植物体内, 酸性磷酸酶主要累积在液泡中, 大量研究表明, 酸性磷酸酶在调控植物磷营养方面有着非常重要的作用, 它在有机磷的代谢及再利用过程中也起着十分重要的作用, 其活性直接影响着有机磷有效性的高低。

在植物体内, 酸性磷酸酶对有机磷的再利用主要通过2 个功能来实现:1)将植物体内的有机磷转化为无机磷;2)将植株中的磷从衰老组织转运到幼嫩组织。梁宏玲的研究表明, 低磷胁迫下, 磷高效品种97081 体内酸性磷酸酶活性高于磷低效品种97009 , 低磷条件下97081 各部位酸性磷酸酶活性比97009 相应部位增加的幅度大, 植物体内磷素的分组结果也是97081 的相应部位的可溶性磷占总磷的比例高于97009 , 说明97081 在低磷条件下, 酸性磷酸酶受到强烈的诱导, 其活性大幅度增加。97081体内磷的代谢较97009 快, 可溶性磷占总磷的比例高, 更有利于加快磷的运输, 促进磷的再利用。类似的研究结果在以前的研究中已有报道。为植物提供不同形态的有机磷源, 植物的生长存在差异, 说明不同的有机磷对植物的有效性是有差异的。Yadav 等利用植酸钙镁、卵磷脂、甘油磷酸3 种形态的有机磷和可溶性无机磷作磷源研究9 种谷类作物和油料作物时发现, 同一时间各处理作物分泌酸性磷酸酶的活性顺序为:缺磷对照>植酸钙镁>卵磷脂>甘油磷酸>无机磷。酸性磷酸酶活性随有机磷水解难度的增加而增加。在以有机磷作磷源进行不同作物根系分泌A PA 研究时, 还出现了不同的结果。例如Adams 等以植酸态有机磷和RNA 作磷源对2 种白羽扇豆根系分泌酸性磷酸酶活性的研究发现, 按酸性磷酸酶活性大小排列各处理, Lupinus angust i folius L .顺序为:RNA >植酸态>不施磷>无机磷;而Lupinus albus L .顺序为:不施磷>RNA >植酸态>无机磷, 引起这种差异的原因还不清楚。因此, 在缺磷条件下, 根系分泌到土壤中的酸性磷酸酶主要水解何种形态有机磷, 土壤种哪种形态有机磷对植物有效性更高等问题都需要进一步研究2。

酸性磷酸酶分泌的基因控制分泌酸性磷酸酶是植物普遍存在的一种对低磷胁迫的适应性反应, 而这种适应性变化也是磷缺乏响应基因协调表达的结果, 通过响应基因产物的直接或间接作用, 促进磷素的吸收、转运和有效利用,有关酸性磷酸酶基因的研究已经取得了很大的进展。Goldstein 等研究发现, 番茄根系在低磷胁迫下可诱导分泌性酸性磷酸酶的产生, 并具有基因表达调节和系列信号传递系统。在白羽扇豆上也同样发现存在类似基因, 低磷胁迫能诱导其增强表达, 表明植物体内可能存在着低磷胁迫诱导的控制酸性磷酸酶分泌的基因。目前, 一些控制酸性磷酸酶分泌的基因已经在植物体内被定位和分离。LAS AP1 是从白羽扇豆分离到的编码分泌酸性磷酸酶的基因, 其全长为2187 bp , 包含有一个1 914bp 长的编码框, 编码由637个氨基酸残基组成的多肽, 氨基酸序列与外泌酸性磷酸酶的序列一致2。

碱性磷酸酶简介及发现碱性磷酸酶(alkaline phosphatase , EC 3 .1 .3 .1 ,AP)是非特异性磷酸单酯酶, 可以催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应, 生成无机磷酸和相应的醇、酚、糖等, 还可以催化磷酸基团的转移反应, 且大肠杆菌A P 还是一种依赖亚磷酸盐的氢化酶。AP 存在于除高等植物外几乎所有的生物体内, 可直接参加磷代谢, 在钙、磷的消化、吸收、分泌及骨化过程中发挥了重要的作用。1911 年Levene 等、1912 年Grosser 等分离到(碱性)磷酸酯酶;1934 年, Davis 提出了碱性磷酸酶这一命名;1958 年,Ag ren 等用同位素标记的方法分离到磷酸丝氨酸;1961 年, Schwartz 在大肠杆菌中也发现了这一复合物, 并认为丝氨酸可能是AP 活性部位的组成成分;1962 年, Plocke 等证实AP 是一种金属酶;1981 年, Bradshaw 测定了大肠杆菌AP 氨基酸全序列, 并克隆了大肠杆菌AP 的基因phoA ;之后多种生物AP 的基因相继被克隆, 近些年对AP 的结构、作用机制和功能的研究越发深入, 使AP 的应用更加广泛3。

应用AP 在医学和分子生物学等领域有广泛的用途。在临床医学上, 测定血清中AP 的活力已成为诊断和监测多种疾病重要手段。AP 主要用于阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性肝癌、胆汁淤积性肝炎等的检查, 患这些疾病时, 肝细胞过度制造AP , 经淋巴道和肝窦进入血液, 同时由于肝内胆道胆汁排泄障碍, 反流入血而引起血清AP 明显升高。而血中肠型AP 明显升高可见于各种肠道疾病, 也有文献报道某些消化系统疾病、自身免疫性疾病及恶性肿瘤患者血中还可以出现免疫球蛋白复合物型AP , 此种A P 同工酶出现的机理尚未清楚。AP 同工酶作为肿瘤组织的一个标志也逐渐为人们所认识, 如肺脏、睾丸、卵巢、胰腺、结肠和淋巴组织等恶性肿瘤病人血清中含有PLA P 。骨型AP 作为骨代谢异常的标志物越来越受到临床重视;血清骨型A P 活力的定量测定可作为监测骨形成变化的有效参数, 在其他的骨代谢异常疾病(如骨软化症、佝偻病等)及早期甲状腺机能亢进的病人、慢性肾衰病人、接受肾脏移植的病人血清中的骨型AP 活性均有不同程度的改变, 对骨型AP 活性的检测及动态观察将为疾病的早期诊断、治疗效果的监测、病情预后等提供有效的依据。

在动物饲养和疾病诊断方面, AP 是反映成骨细胞活性、骨生成状况和钙、磷代谢的重要生化指标。钙、磷供应不足对动物的影响主要表现为骨结构异常、软骨病、食欲降低、生长迟缓、生产性能下降等。年幼动物血液AP 主要来自骨骼, 随着动物长大成熟和骨骼成年化, 来自骨骼的AP 逐渐减少。在动物营养研究中, 血清AP 活性常作为重要的生化检测指标协助评定日粮钙、磷水平的适宜程度。在动物疾病诊断上, 依据骨质疏松等骨骼疾病发生时AP 活性的变化规律, 可应用血清AP 活性来诊断因钙、磷及VD 失调所引起的骨质疾病。临床骨型AP 的检测比血钙测定体内钙营养水平更具敏感性, 因此, 国内外研究一致认为骨型AP 是反映骨改变全过程最正确的指标, 其特异性、灵敏度及准确性优于其它物质的检测。另外, 在动物患肝疾患、胃肠疾患、肾脏疾病和缺锌时, 血清AP 均会有改变, 如果继续对脏器特异性、A P 变化机制、AP 在不同动物体内生理功能深入研究, 会使AP 在兽医临床上意义更大。

在免疫学研究方面, 已广泛应用AP 标记抗体进行酶联免疫荧光反应(E LISA)和Western 印迹分析, 即将A P 与显色剂或去磷酸化后能发光的底物相互作用来揭示靶与检测酶复合物的存在, 与辣根过氧化物酶相比, AP 用作标记酶的优点是稳定性高、灵敏度高, 缺点是成本高、标记困难。在生物化学和分子生物学方面, 用AP 催化除去DNA 分子的5′末端磷酸基团以防止载体自连是基因克隆中的常规手段之一。用AP 脱去5′末端磷酸基团, 再用(γ-3 2P)A TP 标记5′末端, 可用于化学测序, RNA 测序和特异性DNA 或RN A 片段的图谱构建。应用AP 代替同位素标记核苷酸探针用于分子杂交。研究中最常用的AP 有:①细菌碱性磷酸酶(BAP);② SAP(来源于一种北极虾);③小牛肠碱性磷酸酶(CIAP);④胎盘碱性磷酸酶(PLAP)和分泌性碱性磷酸酶(SEAP), 后者是前者的C 末端短缺版, 与PLAP 相比, SEAP 没有PLAP 的C末端最后24 个氨基酸(这24 个氨基酸构成了与糖基化磷脂酰肌醇靶向锚定的区域)。另外, 将phoA基因与其它基因融合表达杂合蛋白可用于基因表达的研究。在1995 年还报道了以AP 作为识别元件的生物传感器。目前工业上一个普遍的应用是基于巴氏杀菌可破坏AP , 因此将AP 作为检验牛奶的巴氏灭菌的标志3。