[科普中国]-生物活素

简介

在不含有这种微量物质的合成培养基中，酵母不能增殖。其有效成分，已确定的有肌醇（生物活素Ⅰ）、β-丙氨酸、泛酸（生物活素Ⅱa）及由F.Kgl分离的生物活素（生物活素Ⅱb，维生素H，辅酶R）等。

研制(1)将粗制的海藻酸聚多糖、海洋甲壳胺活素按比例用生物技术进行45℃加温、溶解、提纯。

(2)将海洋生物复合酶用提纯的具有活性的生物液进行吸附包被。按比例溶解于纯净水中加热54℃ ,再进行磁力搅拌、乳化反应,再按比例纯化水中进行冷却。

菌片的制备 试验菌为金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(8099)、白色念珠菌(ATCC 10231)。用磷酸盐缓冲液(PBS)将其24 h新鲜培养物洗下,制成菌悬液,染于脱脂的无菌布片(1 cm× 1 cm)上,干燥,制成含菌量为5× 105～ 106 cfu/片的菌片。

中和剂鉴定试验 试验指示菌为金黄色葡萄球菌、白色念珠菌。试验设平行8组。结果判定,以第1组不长菌或有少量菌生长且少于第2组,第2组菌数> 50 cfu/ml;第3、4、5组间菌数相差不超过15%且在规定范围;第6、7、8组不长菌;试验重复3次结果一致,表明所选中和剂及浓度适宜。

载体浸泡定量杀菌试验 按每片5.0 ml的量,吸取相应浓度的生物活素注入无菌平皿中。置(20± 1)℃水浴箱内5 min后,分别放入预先制备的菌片3片。作用至预定时间,取出菌片,分别移入到盛有5.0 ml中和剂溶液的试管中振敲混匀试管80次,取1.0 ml接种无菌平皿,倾注普通营养琼脂培养基(白色念珠菌用沙堡葡萄糖琼脂),于37℃温箱培养48 h计数平板菌落数,试验重复3次(包括对照);计算平均杀灭率。判定结果以平均杀灭率大于99.90%为消毒合格。

稳定性试验 将装有1 000 ml该消毒剂的原装玻璃瓶两支(瓶口盖以胶塞后外加塑料膜密封)置54 ℃温箱14d、37℃温箱90 d。于放置前、后,分别取样检测对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的杀灭效果。作用时间分组及其他试验条件均与原载体浸泡定量杀菌试验相同。储存后样品增加10%的浓度,对微生物的杀灭效果仍能达到消毒的要求,可判为通过。

金属腐蚀性试验 金属片为圆形直径24.0 mm,厚1.0 mm,穿一直径为2.0 mm小孔,表面积总值约为9.80cm2,光洁度为6。铜、铝片、碳钢、不锈钢,用清洁洗涤剂浸泡,去油,洗净;以120号粒度水砂纸磨去金属表面的氧化层,再用自来水冲净。测量片的直径、厚度、孔径(精确至0.1 mm)。用无水丙酮再次脱脂。置50 ℃恒温箱中干燥1 h后将处理后的金属片放天平内称重,为试验前重量。分别(每种3片)挂在4个烧杯600 ml最高使用浓度消毒液中浸泡72 h,浸泡规定时间后取出金属片除去腐蚀产物并清洗后,用粗滤纸吸干水分,干燥1 h后分别在天平上称重。作为试验后重量。同时做对照。计算腐蚀速率和腐蚀度。

影响因素试验 有机物对杀菌效果的影响试验:干扰物为小牛血清,设置对照组;含25%小牛血清组;含50%小牛血清组等3组。各组所用海洋生物活素消毒液浓度和作用时间,同杀菌试验。

毒性试验

急性经口毒性试验 选体重为20～ 22 g的昆明种一级小鼠20只,雌、雄各半,一次经口灌胃试验剂量药液后观察14 d,记录小鼠各种症状和死亡情况。

蓄积毒性试验 取体重为180～ 200 g的昆明种一级大鼠20只,雌、雄各半。按体重计算染毒剂量,第1～ 4 d染毒剂量为0.1 LD50,以后每4 h递增1.5倍剂量,直至28 d。每4 h称重1次。

急性眼刺激试验 用健康白色家兔4只,体重2.5～ 3.0 kg,将该剂原液0.1 ml滴入家兔左眼结膜囊内,被动闭合4 s后用生理盐水冲洗,右眼为对照。于滴眼后6、24、48、72 h和4、7 d观察并记录眼局部刺激反应。

急性皮肤刺激试验 取4只健康白色家兔,体重2.5～ 3.0 kg,将背部脊柱两侧毛分别3.0 cm× 3.0 cm,不损伤表皮。将0.2 ml该剂原液均匀涂抹在左侧皮肤上,用二层纱布和玻璃纸覆盖后固定。右侧皮肤作为空白对照。于除去受试物后1、24、48 h分别观察皮肤反应。

小鼠骨髓细胞微核试验 选用50只健康小鼠,随机分为5组,每组雌、雄各5只,共设3个剂量组,剂量设计分别为1/2LD50、1/5LD50、1/20LD50mg/kg体重,另设阴性对照及阳性对照,阳性组给予环磷酰胺40 mg/kgBW。受试物及阳性物均经口灌胃,采用30 h给药法,即两次给药间隔24 h,于末次给药后6 h,常规取股骨骨髓制片、固定、染色,于油镜下对每只动物观察1 000个嗜多染红细胞,计算微核率,进行统计学分析。

小鼠精子畸形试验 选用25只雄性健康小鼠,随机分为5组,每组各5只,共设3个剂量组,剂量设计分别为1/2、1/5、1/20LD50,另设阴性对照及阳性对照,阳性组给予环磷酰胺40 mg/kgBW。阴性对照为蒸馏水。受试物、阴性对照物及阳性物均经口灌胃,连续5 d,于首次给药后的第35 d处死动物,取副睾制片、固定、染色,于油镜下对每只动物计数2 000条精子,计算精子畸形发生率,进行统计学分析。

杀菌效果中和剂试验结果

试验表明,用金黄色葡萄球菌、白色念珠菌试验,慈华牌海洋生物活素300 mg/ L稀释液用含40 g/ L吐温- 80+ 20 g/ L卵磷脂+ 10 g/ L甘氨酸※PBS缓冲液,可有效中和试验浓度的海洋生物活素消毒液残余作用,结果符合规定要求。

杀菌结果

结果表明,在19～ 21 ℃条件下,以含体积分数300 mg/ L海洋生物活素溶液作用2 min,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌平均杀灭率为99.99%;作用5 min,对白色念珠菌作用杀灭率均达99.99%,见表1。

稳定性

试验表明,慈华牌海洋生物活素在54 ℃下放置14 d, 37℃、相对湿度80%放置90 d有效成分下降率为6.12%,杀菌效果无明显影响,见表2。

金属腐蚀性

经72 h生物活素金属腐蚀性试验结果,对不锈钢、铜无腐蚀性,对碳、钢、铝基本无腐蚀性。

影响因素试验

有机物对杀菌效果的影响试验:染布片菌悬液中含体积分数50%小牛血清对该剂杀菌效果无明显影响。

毒性

在急性经口毒性试验中,小鼠染毒后未见异常反应外。未出现死亡,表明该剂原液对雌、雄小鼠急性经口LD50> 5 000 mg/kg。按化学物质急性毒性分级标准属实际无毒性。蓄积毒性试验给药20 d,雌、雄小鼠均无死亡情况发生,小鼠蓄积系数K> 5,按蓄积毒性分级标准为弱蓄积毒性。家兔皮肤刺激试验,该剂原液对皮肤刺激反应积分均值为0。按“皮肤刺激强度分级”标准属无刺激性。家兔急性眼刺激试验,该剂原液滴眼4 s后冲洗,对动物急性眼刺激积分指数为3,按“眼刺激强度评价标准”对眼无刺激性。小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验为应阴性,无致突变性。精子畸形试验结果为阴性。1