[科普中国]-有限细胞系

有限细胞系

初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称为细胞系，如细胞系的生存期限有限，则称之为有限细胞系(finite celline)细胞分裂存在一个极限，达到该极限值后，细胞将不再分裂并衰老，死亡，不能进行无限增值。

毛冠鹿胚胎有限细胞系的建立鹿科动物具有较高的经济价值，毛冠鹿属是鹿科麂亚科的2个属之一，仅有毛冠鹿(Elaphodus cephalophus)一种动物，为我国特有的二类保护动物。近年来，由于生态环境恶化，食物链遭到破坏，该动物日趋减少。1983年张锡然等首次报道了毛冠鹿2种核型，王宗仁又发现了第3种核型。3种核型差异较大，这种差异并不影响个体的表型及生存。因此，毛冠鹿不同个体的细胞遗传学的染色体进化研究是麂亚科动物的重要研究领域。建立该种动物的细胞系，对研究其染色体多态机制和进化以及物种遗传、资源保护，都具有重要意义。笔者采用组织块培养方法以建立毛冠鹿胚胎肺和肾有限细胞系，并对细胞形态、生长速度和染色体形态等生物学特性进行了研究。

原代培养毛冠鹿细胞原代培养参见施立明等的方法，在无菌条件下取出毛冠鹿胚胎的肺和肾组织，用含双抗(青霉素、链霉素各0.1U/mL)的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，去血污，再用GIBCO199培养液洗1次。在无菌培养皿中剪成1mm×1mm×1mm大小的组织块，置培养瓶中贴壁，翻转180°，CO2培养箱内静置37℃培养。24h后翻转培养瓶，补充数滴培养液，96h后加5mL培养液继续培养。每天用倒置显微镜观察细胞形态。

传代培养细胞长成致密单层后，弃去培养液，加入0.25%胰酶2～3mL，37℃消化约1min，弃去胰酶，加入培养液，用吸管反复吹吸至细胞脱落，以1∶2(按原代培养的细胞数)传代。将胚肺细胞按5.1万个/mL，胚肾细胞按2.1万个/mL的浓度分别接种在同一规格的20只培养瓶中，每天取3只培养瓶，胰酶处理，使细胞脱落，进行计数，取平均值，绘制生长曲线。

细胞遗传学分析染色体分析参照张锡然等方法进行。选取图像清晰的10张中期照片，测量并统计相对长度、臂比和着丝粒指数，表示并绘制核型模式图。

毛冠鹿胚肺和胚肾有限细胞系的建立：组织块贴壁5d后，细胞逐渐从组织边缘生出，7d后形成生长晕，10d后长成致密单层。开始传代培养，并获成功，有限细胞系建立。毛冠鹿胚肺和胚肾原代细胞形态呈放射状向组织块周围扩散，形成致密单层。细胞轮廓清晰，立体感强。胚肺传代细胞呈均一的纤维状，3～4d可形成致密单层。胚肾细胞多数情况下形成不规则的分枝状，细胞所占空间较大1。

干细胞有限细胞系的建立目的:建立脑源性神经营养因子基因修饰的人骨髓间充质干细胞系。

方法:常规分离培养人骨髓间充质干细胞，流式细胞术检测骨髓间充质干细胞表面分子CD34、CD44、CD45，采用重组逆转录病毒载体将脑源性神经营养因子基因转入人骨髓间充质干细胞。检测脑源性神经营养因子基因修饰的骨髓间充质干细胞的增殖特性，细胞内脑源性神经营养因子的蛋白表达，细胞培养液中脑源性神经营养因子含量，以及PCR检测脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞中外源性脑源性神经营养因子基因DNA。

结果:①人工分离培养出的骨髓间充质干细胞，形态、大小一致，呈长梭型或长多边形，从P0至P20基本保持一致，P2代骨髓间充质干细胞表达基质细胞表面标志CD44，不表达造血系细胞表面标志CD34、CD45。②反转录病毒感染骨髓间充质干细胞的感染效率约为10%，修饰后形成的脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞在形态上始终保持一致，与骨髓间充质干细胞几乎完全一样，生长速率与未经基因修饰的骨髓间充质干细胞基本相同，培养10代后细胞停止分裂，免疫细胞化学染色显示脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞的脑源性神经营养因子阳性率超过98%，培养72h后培养基中脑源性神经营养因子的含量较之骨髓间充质干细胞提高约20000倍。③PCR对脑源性神经营养因子-骨髓间充质干细胞基因组DNA进行扩增，得到外源性脑源性神经营养因子条带。结论:利用反转录病毒载体进行基因修饰得到了稳定的脑源性神经营养因子基因修饰的人骨髓间充质干细胞有限细胞系，为基因治疗提供了一种以多潜能成体干细胞为载体的种子细胞2。