[科普中国]-重折叠

【分类】有些蛋白，尤其是小分子的肽类，很容易复性，例如高表达干扰素、肿瘤坏死因子等用强变性剂盐酸胍破菌溶解，稀释后去除变性剂，就能表现出良好活性。而大分子蛋白以及二硫键较多的分子，重折叠就较困难，有的根本就难以复性。例如高表达的Era蛋白，用尿素溶解后，在其底物GDP(鸟苷二磷酸)存在下，极缓慢地降低尿素浓度，最后去除尿素，也只有半数Era可复性溶解。由此可见蛋白质的复性或重折叠是一个十分复杂的过程，而它又是应用生化工程技术的关键，所以有许多学者对多肽链是如何折叠形成具有生物活性蛋白质的过程进行了艰苦的研究。

【重折叠途径】蛋白质折叠的热力学和动力学控制用热力学和动力学分析的方法，对重折叠途径的步骤进行研究，其目的在于“活化”宿主微生物系统表达的无活性重组蛋白。为此先要阐释或假设存在于蛋白质的初级结构，以初步确定折叠途径的折叠密码。如果能破译折叠密码，就可以用DNA顺序对蛋白质结构进行预测，并通过重组DNA技术对蛋白质结构进行分子改造，从而确定某一给定氨基酸顺序的生物学功能。

①经典的“热力学假说”——变性重折叠过程中热力学上的可逆性。

②变性一重折叠过程中热力学上的竞争性。随着对蛋白折叠研究的广泛开展，发现许多蛋白质在体外的变性一重折叠过程并非完全可逆1

【重折叠方法的选择】

在绝大多数情况下．溶解变性的异源蛋向完全丧失了空间构象。如果异源蛋白在溶解变性过程中并不是100%的处于非折叠状态，或者还原型的蛋白质是可溶性的(如肿瘤坏死因子TNF)，则下游操作可简单地包括离心、缓冲液交换、二硫键氧化，必要时进行层析纯化。如果异源蛋白是完全变性的，则必须进行重折叠操作，并尽可能避免部分折叠中间产物形成不溶性集聚物。为达到此目的可采取下列方法：

(1)一步稀释法

蛋白质集聚作用属于多级动力学反应，严格依赖于蛋白质的浓度。在稀释过程中，重折叠与集聚作用的相互竞争可用数学模型关联，而且重折叠蛋向质的回收率可由两个反应的速度常数推算。硅然，在重折叠操作中，降低蛋白质浓度可以在很大程度上抑制集聚作用。例如，牛生长激素在重折叠反应中的浓度为1．6 mg/mI。时，可以观察到部分折叠中间产物的形成，但在稀释100倍后，折叠中间产物便不会大量形成，这种浓度恰恰是牛生长激素体外折叠的最佳条件。然而，重折叠反应液高倍数的稀释不仅增加了复性缓冲液的消耗成本，而且也为后续纯化T序带来了很大麻烦。应当指出的是。蛋白质性质不同，其最佳重折叠所对应的蛋白浓度差别很大．有些蛋白质可在0．1～10 mg/mL的浓度内溶解完全，并足以进行有效折叠。

(2)分段稀释法

对于那些非折叠和部分折叠状态不溶于水的蛋白质，往往采用分步稀释的方法对之进行有效复性。变性蛋白在启动体外复性和重折叠时，不但变性剂的性质和浓度对折叠率有很大影响，而且对其变化速度的掌握也至为重要，也就是说，变性剂的更换或稀释速度快慢对重折叠的影响因蛋I上I质而异。稀释速度加快有利于重折叠的典型例子是色氨酸酶，它在3 mol/L的尿素溶液中极易形成部分折叠中间产物的集聚作用，因此从8 mol/L尿素的变性溶液透析至低浓度时，必须加快透析速度．使得色氨酸酶在3 mol/l，尿素溶液中的存在时间尽可能最短。反之．若将含有牛生长激素的2．8～5 mol/l。盐酸胍溶液迅速稀释到复性重折叠所需的低浓度，会使产物大量的不可逆沉淀，但若将这个溶液先稀释至2 mol/I。盐酸胍浓度，并保温一段时间，此时难溶性的折叠中间产物逐步趋于溶解，在此基础上进一步的稀释则可获得高产率的天然蛋向。应当特别指出的是，在上述分段稀释法中，重折叠蛋白的产率还与蛋白质浓度密切相关．所采用的稀释倍数也受到缓冲液pH、离子组成及保温温度的显著影响。与天然折叠蛋白的等电点沉淀性质相似，在重折叠过程中应当避免折叠缓冲液的pH接近重组异源蛋白质的等电点pl。除此之外，还应注意选择缓冲液的离子种类及使用浓度。由于阴离子对蛋白质疏水作用强度产生性质不同的影响，它们同时兼有稳定蛋白质折叠结构以及诱导折叠蛋白集聚的双重功能。各种阴离子的作用强度次序为：Soj一>HPo；>Ac>Ci”>C12>N03一>T一：>Cl()1：>SCN(其中Ci=卜为柠檬酸根)，其中多价阴离子的双重功能一般比单价阴离子要强。

(3)特种试剂添加法

在复性折叠系统巾，某些特殊化合物的存在可以提高很多蛋白质的重折叠率。例如，0．2mol/L的精氨酸可以明显改善重组人尿激酶原(pro-UK)的活性回收率，同样条件也适用于组织型血纤维蛋白溶酶原(t—PA)以及免疫球蛋白片段的体外重折叠。0．1 mol/I．的甘氨酸能提高松弛肽激素的折叠产率，而血红素和钙离子则能促进重组马过氧化酶的重折叠反应。另外，有些中性分子如甘油、蔗糖、聚乙二醇等，也能稳定蛋白质的天然构象，在某些情况下，将这些中性物质加入折叠缓冲液中，可以改善蛋白质的体外重折叠产率。

(4)蛋白化学修饰法

胰蛋白酶原的重折叠很难用上述的缓冲液交换方法实现，然而在变性条件下，若将这个蛋白质的游离巯基特异性保护，然后再将蛋白分子进行柠檬酸酐酰化修饰，则修饰后的胰蛋白酶原可溶于非变性的缓冲液中，从而促进重折叠反应的顺利进行。在上述修饰反应中所使用的酸酐活性试剂能可逆性地修饰多肽链上的游离氨基，并将其正电荷转换成负电荷，从而使蛋白质形成多聚阴离子状态，后者通过分子问的斥力阻止集聚作用的发生。一旦修饰蛋白氧化并转人非变性溶液中，将pH调低至5．0，即可通过脱酰基反应回收具有天然折叠构象的蛋白产物。这一方法的效果已为后来的多次实验所证实，特别适用于包涵体型重组蛋白的活性回收。蛋白质的化学修饰也可用于防止因二硫键错配所产生的共价集聚作用。在变性溶解状态下，将多肽链上的所有游离巯基全部烷基化封闭，然后进行复性重折叠操作，最终脱去烷基并在氧化条件下修复二硫键。

(5)重折叠分子隔离法

蛋白质及其折叠中间产物的集聚作用依赖于分子之间的碰撞与接触，因此将非折叠蛋白分子固定化，从理论上来说可以从根本上杜绝集聚作用的产生，实验结果也证明这一思路的实用价值。例如，将非折叠状态的胰蛋白酶原固定在琼脂糖球状颗粒上，然后用一种复性缓冲液平衡层析柱，即可回收71%的酶活性。如果固定在层析介质上的蛋白质能方便地可逆性回收，那么就可实现蛋白原位重折叠，最终通过特定的解离溶剂从重折叠层析柱上洗脱天然构象的活性蛋白产物。这项技术已被成功地用于包涵体型重组蛋白的重折叠，只是精细的操作条件尤其是层析介质对蛋白质的亲和性尚有待于逐一建立。2