[科普中国]-微生物发酵

发酵方法

微生物发酵过程根据发酵条件要求分为好氧发酵和厌氧发酵。好氧发酵法有液体表面培养发酵、在多孔或颗粒状固体培养基表面上发酵和通氧深层发酵几种方法。厌氧发酵采用不通氧的深层发酵。因此，无论好氧与厌氧发酵都可以通过深层培养来实现，这种培养均在具有一定径高比的圆柱形发酵罐内完成，就其操作方法可分为以下几种。

分批式操作：底物一次装入罐内，在适宜条件下接种进行反应，经过一定时间后，将全部反应物取出。

半分批式操作：也称流加式操作。是指先将一定量底物装入罐内，在适宜条件下接种使反应开始。反应过程中，将特定的限制性底物送入反应器，以控制罐内限制性底物浓度在一定范围，反应终止将全部反应物取出。

反复分批式操作：分批操作完成后取出部分反应系，剩余部分重新加入底物，再按分批式操作进行。

反复半分批式操作：流加操作完成后，取出部分反应系，剩余部分重新加入一定量底物，再按流加式操作进行。

连续式操作：反应开始后，一方面把底物连续地供给到反应器中，同时又把反应液连续不断地取出，使反应过程处于稳定状态，反应条件不随时间变化。3

分批发酵法(batch fermentation)分批发酵又称分批培养，发酵工业中常见的分批发酵方法是采用单罐深层分批发酵法。每一个分批发酵过程都经历接种、生长繁殖、菌体衰老进而结束发酵，最终提取出产物。这一过程在某些培养液的条件支配下，微生物经历着由生到死的一系列变化阶段，在各个变化的进程中都受到菌体本身特性的制约，也受周围环境的影响。只有正确认识和掌握这一系列变化过程，才有利于控制发酵生产。

分批发酵的特点是：微生物所处的环境是不断变化的，可进行少量多品种的发酵生产，发生杂菌污染能够很容易终止操作，当运转条件发生变化或需要生产新产品时，易改变发酵对策，对原料组成要求较粗放等。

分批培养过程微生物生长可分为：停滞（或调整）期、对数（生长）期、稳定期和衰亡期四个阶段。研究细胞的代谢和遗传宜采用生长最旺盛的对数期细胞。在发酵工业生产中，使用的种子应处于对数期，把它们接种到发酵罐新鲜培养基时，几乎不出现停滞期，这样可在短时间内获得大量生长旺盛的菌体，有利于缩短生产周期。在研究和生产中，常需延长细胞对数生长阶段。

补料分批发酵法(fed-batch fermentation)补料分批发酵又称半连续发酵或半连续培养，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。与传统分批发酵相比，其优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。低基质浓度的优点为：①可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不致加剧供氧的矛盾；②避免培养基积累有毒代谢物。

补料分批发酵广泛应用于抗生素、氨基酸、酶制剂、核苷酸、有机酸及高聚物等的生产。

连续发酵法(continuous fermentation)连续发酵又称连续培养，连续发酵过程是当微生物培养到对数期时，在发酵罐中一方面以一定速度连续不断地流加新鲜液体培养基，另一方面又以同样的速度连续不断地将发酵液排出，使发酵罐中微生物的生长和代谢活动始终保持旺盛的稳定状态，而pH值、温度、营养成分的浓度、溶解氧等都保持一定，并从系统外部予以调整，使菌体维持在恒定生长速度下进行连续生长和发酵，这样就**提高了发酵的生长效率和设备利用率。

开放式连续发酵

在开放式连续发酵系统中，培养系统中的微生物细胞随着发酵液的流出而一起流出，细胞流出速度等于新细胞生成速度。因此在这种情况下，可使细胞浓度处于某种稳定状态。另外，最后流出的发酵液如部分返回(反馈)发酵罐进行重复使用，则该装置叫做循环系统，发酵液不重复使用的装置叫做不循环系统。

封闭式连续发酵

在封闭式连续发酵系统中，运用某种方法使细胞一直保持在生物反应器内，并使其数量不断增加。这种条件下，某些限制因素在生物反应器中发生变化，最后大部分细胞死亡。因此在这种系统中，不可能维持稳定状态。封闭式连续发酵可以用开放式连续发酵设备加以改装，只要使用部分菌体重新循环。另一种方法是采用间隔物或填充物置于设备内，使菌体在上面生长，发酵液流出时不带细胞或所带细胞极少。

透析膜连续发酵是一个新方法，它是采用一种具有微孔的有机膜将发酵设备分隔，这种膜只能通过发酵产物，而不能通过菌体细胞。这样，将培养液连续流加到发酵设备的具有菌体的间隔中，微生物的代谢产物就通过透析膜连续不断地从另一间隔流出。在一些发酵过程中，当发酵液中代谢产物积累到一定程度时就会抑制它的继续积累，而采用透析膜发酵的方法可使代谢产物不断透析出去，发酵液中留下不多，因而可以提高产物得率。4

应用领域与范围微生物发酵生产水平主要取决于菌种本身的遗传特性和培养条件。发酵工程的应用范围有：

医药工业，食品工业，能源工业，化学工业，农业：改造植物基因；生物固氮；工程杀虫菌生物农药；微生物饲料。环境保护等方面。

酒类包括果酒、啤酒、白酒及其他酒均是利用酿酒酵母，在厌氧条件下进行发酵，将葡萄糖转化为酒精生产的。白酒经过蒸馏，因此酒的主要成分是水和酒精，以及一些加热后易挥发物质，如各种酯类、其他醇类和少量低碳醛酮类化合物。果酒和啤酒是非蒸馏酒，发酵时酵母将果汁中或发酵液中的葡萄糖，转化为酒精，而其他营养成分会部分被酵母利用，产生一些代谢产物，如氨基酸、维生素等，也会进入发酵的酒液中。因此，果酒和啤酒营养价值较高。

醋食品店或超市出售的醋中，除了白醋是由化学合成的食品级醋酸勾兑的外，其他的则是由醋酸菌在好氧条件下发酵，将固体发酵产生的酒精转化为醋酸生产的。由于使用的微生物菌种或曲种的差异，在葡萄糖发酵过程中会产生乳酸或其他有机酸，因而使醋有不同的风味。

酱油酱油生产以大豆为主要原料，其他有麦麸、小麦、玉米等，将上述原料经粉碎制成固体培养基，在好氧条件下，利用产生蛋白酶的霉菌，如黑曲霉进行发酵。微生物在生长过程中会产生大量的蛋白酶，将培养基中的蛋白质水解成小分子的肽和氨基酸，然后淋洗、调制成酱油产品。酱油富含氨基酸和肽，具有特殊香味。

酸奶牛奶在厌氧条件下，由乳酸菌发酵，将乳糖分解，并进一步发酵产生乳酸和其他有机酸，以及一些芳香物质和维生素等；同时蛋白质也部分水解。因此，酸奶是营养丰富、易消化，少含乳糖，是适合于有乳糖不适应症者的优良食品。

醪糟又称酒酿，是大米经蒸煮后，接种根霉，在好氧条件下，发酵生产的含低浓度酒精和不同糖分的食品。根霉在生长时会产生大量的淀粉酶，将大米中的淀粉水解成葡萄糖，同时利用部分葡萄糖发酵产生酒精。由于使用的根霉菌种不同，可以生产不同酒精度、不同甜度和不同香味的醪糟。

面包面包均是利用活性干酵母（面包酵母）经活化后，与面粉混合发酵，再加入各种添加剂，经烤制生产的。面粉发酵后淀粉结构发生改变，变得易于消化、营养易于吸收。

糖果、饼干、果冻等添加了红曲色素，以调节色泽；

果汁、饼干、面包、点心、方便面等添加了黄原胶，起悬浮、稳定、增稠、改善口感、防止粘牙、延长储存期等作用；

各类罐头，包括蔬菜、水果、蘑菇、鱼类、肉类、蛋类罐头，香肠，包装奶等添加了乳链杆菌肽，以保鲜、防腐，保存营养和改善口感等；

各种果汁、啤酒和饮料中均需使用柠檬酸或乳酸作为酸味剂调节口味、口感；

饭店、食堂和家庭制作的菜肴中常加味精或肌苷，以增加鲜味。

相关概念初级代谢产物微生物通过初级代谢途径，产生微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物。

次级代谢是微生物在一定的生理阶段出现的一种特殊代谢类型，是某些微生物为了避免在代谢过程中某些代谢产物的积累造成的不利作用，而产生的一类利于生存的代谢类型，次级代谢产物通常是在生产后期合成。

湿热灭菌法按被灭菌物品的性质不同，选择不同温度的湿热蒸汽进行灭菌，此法在同一温度下比干热杀菌效力大。

连续灭菌培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入已灭菌的发酵罐内的灭菌工艺过程，又称连消。

诱变育种利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，扩大变异幅度，通过一定的筛选方法，获取所需要优良菌株的过程。

菌种初筛是从分离得到的大量菌种中将合成目的产物的菌种筛选出来的过程。初筛可分为平板筛选和摇瓶发酵筛选。

菌种复筛对初筛出来的菌种进行复筛，通常采用摇瓶培养法，一般一个菌株至少要重复3~5个瓶，培养后的发酵液必须采用精确分析方法测定。

自然选育在生产过程中，不经过人工诱变处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程。

种子扩大培养是指将保存在沙土管、冷冻干燥管、斜面试管等中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和高质量的纯种的过程。

巴斯德消毒法将待消毒的物品在60~62℃加热30min或在70℃加热15min，以杀死其中的病原菌和一部分微生物的营养体。

辐射灭菌法利用高能量的电磁辐射和微粒辐射来杀死微生物。

微生物转化是指利用微生物代谢过程中的某些酶或酶系将一种化合物转化成含有特殊功能基团产物的生物化学反应。

质粒是一种能够独立复制的染色体外遗传因子。

抗生素是青霉素、链霉素、红霉素和四环素等一类化学物质的总称，是生物在其生命过程中产生的能在低浓度下有选择性地抑制或杀死其他微生物或肿瘤细胞的有机物质。

连续发酵是指以一定的速度向发酵罐内连续添加新鲜培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，微生物在稳定状态下生长或生产。

菌种活化保藏在沙土管、冷冻干燥管或斜面中的菌种经无菌操作接入适合于孢子发芽或营养体生长的斜面培养基中，经培养成熟后挑选菌落正常的孢子或营养体再一次接入试管斜面，反复培养几次**。**

消沫剂工业发酵中用于消除发酵中产生的泡沫，防止逃液和染菌，保证生产的正常运转。

空气分布器是把无菌空气引入发酵罐中并分布均匀的装置，有单孔管、多孔环管及多孔分支环管等几种。

杂交育种一般指两个基因型不同的菌株通过结合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。

基因工程育种是应用基因工程手段进行的，基因工程师一种DNA体外重组技术，是在分子水平上，根据需要，用人工方法取得供体DNA上的基因，在体外重组于载体DNA上，再转移入受体细胞，使其复制、转录和翻译，表达出供体基因原有的遗传性状。

富集培养由于采集样品中各种微生物数量有很大差异，若估计到要哦分离的菌种数量不多时，就要人为增加分离的概率，增加该菌种的数量。

原生质体融合用酶法将细胞膜外侧的细胞壁除掉，制备成无细胞壁的球状细胞体即原生质体，将两种来源于微生物细胞A和B的原生质体，在融合诱导剂的存在下等量混合起来，可使原生质体表面形成电极性，相互之间容易吸引、脱水黏合而形成聚合物，进而使原生质体收缩变形，紧密接触处的膜先形成原生质桥，逐渐增大而实现融合。融合的原生质体在适当条件下可再生出细胞壁而形成一个新细胞。（用脱壁酶处理将微生物细胞壁除去，制成原生质体，再用聚乙二醇促使原生质体发生融合，从而获得异核体或重组合子。）

生物处理法就是在发酵工业废渣水中利用各类微生物的新陈代谢功能进行物质转化的过程，使废水中呈溶解和胶状的有机物被降解并转化成为无害的物质，废渣水中的有机物和一些有毒物质（如酚等）不断被转化分解或吸附沉淀，从而达到净化污水、消除公害的目的。

分批补料发酵又称半连续发酵，是指在微生物发酵过程中，间歇式或连续式补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养技术。

细胞融合技术是把两个亲本的细胞经酶法除去细胞壁得到两个球状原生质体或原生质体球，然后置于高渗溶液中，通过生物法、化学法或物理法等诱导融合法，促使两者互相凝集并发生细胞之间的融合，进而导致基因重组，获得新的重组子（菌株）。这种融合又称为原生质体融合。

单细胞蛋白是指通过培养单细胞蛋白生物而获得的菌体蛋白质。

工程菌通过基因工程改造后的菌株称为“工程菌”。5