[科普中国]-肉毒梭菌检测

肉毒杆菌是一种生长在缺氧环境下的致病菌，全称肉毒梭状杆菌，在罐头食品及密封腌渍食物中具有极强的生存能力，它在繁殖过程中所分泌的肉毒毒素具有极强的毒性，是KCN毒性的一万倍。纯化结晶的肉毒毒素1mg能杀死2亿只小鼠，对人的致死剂量约0.1μg。它通过阻断人体神经接头，导致全身麻痹、瘫痪，严重时能引起人呼吸肌麻痹，导致无法呼吸，最终死亡。目前报道新西兰恒天然浓缩乳清蛋白粉大批量被肉毒杆菌污染，多家产品被卷入其中，科标化工分析检测中心为了我国奶粉质量安全，现开展食品中肉毒杆菌检测。
科标化工分析检测中心可依照ISO、ASTM、DIN、GB、SN等标准完成食品、微生物、饲料、药品、纺织品、农业、高分子材料、生物产品、建筑材料以及微生物产品理化性能、力学性能、电气性能等测试。中心通过了中国国家认证认可监督管理委员会和中国合格评定国家认可委员会的二合一（CMA、CNAS）实验室认证认可，能出具权威的第三方检测报告。

食品中肉毒杆菌检测(PCR检测方法)一、实验原理科标化工分析检测中心结合国标GB/T4789.12-2003食品中卫生微生物学检验肉毒杆菌及内毒素检验和SN/T2525-2010食品中肉毒杆菌的PCR检测方法对食品中肉毒杆菌进行检验。
将样品经增菌后划平板分离单菌落，挑取可疑菌落到胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤(TPGY)培养基培养，对培养物用DNA提取试剂盒抽提DNA，进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物中是否含有肉毒杆菌的的特征条带，从而对食品中是否污染肉毒杆菌进行快速检测。

二、试验方法1、样品的增菌培养
2、培养物分离
3、DNA提取、扩增

四、结果判定阴性对照和空白对照均未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，待测样品出现预期大小的扩增条带则判定为PCR结果阳性，科标化工分析检测中心报告“检出某型（A,B,E,F）肉毒杆菌”。待测样品未出现预期大小的扩增条带则判定为PCR结果为阴性，科标化工分析检测中心报告“未检出某型（A,B,E,F）肉毒杆菌”。

附图1、PCR扩增仪

2、凝胶成像系统

3、厌氧培养箱

4、PCR扩增图谱

肉毒梭菌及肉毒毒素检验1 主题内容与适用范围本标准规定了肉毒梭菌及肉毒毒素的检验方法。
本标准适用于食品和食物中毒样品中肉毒梭菌及肉毒毒素的检验。

2 引用标准GB4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂

3 检验程序肉毒梭菌及肉毒毒素检验程序如下：
注：①报告(一)：检样含有某型肉毒毒素。
②报告(二)：检样含有某型肉毒梭菌。
③报告(三)：由样品分离的菌株为某型肉毒梭菌。
如上所示，检样经均质处理后，及时接种培养，进行增菌、产毒，同时进行毒素检测试验。毒素检测试验结果可证明检样中有无肉毒毒素以及有何型肉毒毒素存在。
对增菌产毒培养物，一方面做一般的生长特性观察，同时检测肉毒毒素的产生情况。所得结果可证明检样中有无肉毒梭菌以及有何型肉毒梭菌存在。
为其他特殊目的而欲获纯菌株，可用增菌产毒培养物进行分离培养，对所得纯菌株进行形态、培养特性等观察及毒素检测，其结果可证明所得纯菌为何型肉毒梭菌。

6操作步骤6.1 肉毒毒素检测
6.1.1 检出试验
6.1.2 确证试验
6.1.3 毒力测定
6.1.4 定型试验
注：①未经胰酶激活处理的检样的毒素检出试验或确证试验若为阳性结果，则胰酶激活处理液可省略毒力测定及定型试验。
②为争取时间尽快得出结果，毒素检测的各项试验也可同时进行。
②根据具体条件和可能性，定型试验可酌情先省略C、D、F及G型。
④进行确证及定型等中和试验时，检样的稀释应参照所用肉毒诊断血清的效价。
⑤试验动物的观察可按阳性结果的出现随时结束，以缩短观察时间；唯有出现阴性结果时，应保留充分的观察时间。
6.2 肉毒梭菌检出(增菌产毒培养试验)
6.3 分离培养
6.3.1 毒素检测：试验方法同4.1。
6.3.2 培养特性检查
注：为检出蜂蜜中存在的肉毒梭菌，蜂蜜检样需预温37℃(流质蜂蜜)，或52～53℃(晶质蜂蜜)，充分搅拌后立即称取20g，溶于100mL灭菌蒸馏水(37℃或52～53℃)，搅拌稀释，以8000～10000r/min离心30min(20℃)，沉淀，加灭菌蒸馏水1mL，充分摇匀，等分各半，接种庖肉培养基(8～10mL)各1支，分别在30℃及37℃下厌?跖嘌?d，按6.2进行肉毒毒素检测。

检测研究进展一、生理生化检测技术1、动物实验法

2、细菌培养法

3、孢子培养法

二、免疫学检测技术1、胶体金免疫层析法

2、乳胶凝集法

3、酶免疫法

4、电化学发光免疫法

三、分子生物学检测技术1、聚合酶链式反应( PCR)

2、荧光定量PCR

3、环介导等温核酸扩增法

4、PCR－DHPLC3

肉毒中毒的预防肉毒中毒的预防，主要是加强食品的卫生管理监督。对病人应尽早根据症状作出诊断，迅速注射A、B、E三型多价抗毒素。若毒素型别已定，可注射相应的抗毒索；直至症状消失。同时要加强护理，对症治疗，特别注意预防呼吸肌的麻痹和窒息，控制呼吸道的继发感染。婴儿肉毒病的治疗是帮助通气呼吸，及维持营养等支持疗法，抗生素和抗毒素不但无效，可能还有害。因为使用了抗生素后，肠内大量的肉毒杆菌突然死亡，毒素释放被短期内大量吸收后会加重病情。4