[科普中国]-肉与肉制品氯霉素含量的测定

范围

本标准规定了畜禽肉中氯霉素的测定方法。

本标准适用于畜禽肉中氯霉素的测定。

本标准检出限：气相色谱-质谱法，检出限为0.2ug/kg；酶联免疫法为0.05ug/kg。1

规范性引用文件下列文件中的条款通过GB/T9695本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。

GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682— 2008，ISO3696：1987，MOD)。

GB/T9695.19 肉与肉制品 取样方法。1

气相色谱-质谱法(确证法)原理样品中氯霉素用乙酸乙酯提取，脂肪用正己烷去除，经C18净化，BSTFA+TMCS(99+1）衍生后，用NCI源选择印m/z为466的特征离子为目标离子，在SIM模式下进行GC-MS测定。

试剂和材料若无特别说明，所用试剂均为分析纯，所用水应符合GB/T6682的要求。

氯霉素：标准品，纯度≥ 99%。

甲醇：色谱纯。

三氯甲烷

正己烷：色谱纯。

乙酸乙酯。

无水硫酸钠。

氯化钠。

N、O-双三甲基硅烷三氟乙酰胺(BSTFΛ )。

三甲基氯硅烷(TMCS)。

丙酮：色谱纯。

甲苯。

甲醇溶液：甲醇+水=2+8。

氯化钠溶液(40g/L)：称取4.00g氯化钠，用水溶解，定容至100mL。

甲醇一氯化钠溶液：量取甲醇溶液20mL、氯化钠溶液80mL，混匀。

混合衍生剂：N、O-双三甲基硅烷dg 氟乙酰胺+三甲基氯硅烷=99+1。

氯霉素标准储备溶液(c=0.1mg/mL)：称取氯霉素标准品0.01g(精确至0.0001g)，用丙酮溶解并定容至100mL。储备液贮存在4℃ 冰箱中，可使用两个月。

氯霉素标准工作溶液：根据试验需要，用丙酮稀释标准储备溶液，配成适当浓度的标准工作溶液。

仪器设备实验室常规设备及下列仪器。

气相色谱-质谱联用仪(GC- MS)。

分析天平：可准确称重至0.0001g。

分析天平：可准确称重至0.01g。

离心机：5500r/min。

涡旋仪。

同相萃取装置。

旋转蒸发仪。

均质器。

振荡器。

机械设备：用于试样的均质。包括：绞肉机、斩拌机等肉类组织粉碎机。

氮吹仪。

具塞离心管：50mL、10mL。

C18固相萃取柱或相当者：200mg，3mL。

分析步骤试样液制备

试样的制备

按GB/T9695.19规定的方法取样。至少取有代表性的试样200g，使用适当的机械设备将试样均质。均质后的试样尽快分析，否则，应密封低温贮存，防止试样变质或成分发生变化。贮存的试样在启用时，应重新混匀。

提取

称取10g样品(精确至0.01g)置于50mL具塞离心管中，加人少量无水硫酸钠和30mL乙酸乙酯均质1min，以5000r/min离心5min后，用吸管吸出上层乙酸乙酯于浓缩瓶中，残渣再加入乙酸乙酯15mL重复提取样品，合并提取液。提取液在50℃ 水浴中旋转蒸发，除去乙酸乙酯，加入l mL甲醇-氯化钠溶液和4mL正己烷，充分振摇后，转移至10mL具塞离心管中，用1mL甲醇-氯化钠溶液清洗浓缩瓶，合并清洗液于10mL具塞离心管中。涡旋0.5min，经3000r/min离心3min后，用吸管吸去正己烷，加人4mL正己烷重复上述操作。然后在离心管中加人4mI乙酸乙酯，涡旋1min，经3000r/min离心3min后，用吸管吸出乙酸乙酯，加入4mL乙酸乙酯重复上述操作，合并乙酸乙酯于浓缩瓶中，在50℃ 水浴中旋转浓缩至近干，用5mL水溶解残渣。

净化

依次用5mL甲醇、5mL三氯甲烷、5mL甲醇、5mL水活化C18固相萃取柱，然后加人上述步骤得到的提取液，加5mL甲醇+水淋洗色谱柱，用25mL甲醇洗脱于浓缩瓶中，洗脱液在50℃ 下浓缩至近干。用100uL甲醇溶解残渣，并转移至10mL具塞离心管中，再用甲醇冲洗浓缩瓶，合并洗液，于50℃ 下用氮气吹干。

衍生化

于吹干的试样残渣中加人100uL甲苯和100uL混合衍生剂，盖紧塞后，涡旋混匀1min，60℃ 下反应30min，然后在50℃ 下用氮气吹干，加入1mL正己烷溶解残渣。

标准工作液制备

配制好的标准工作液按“衍生化”步骤进行操作。

空白液制备

除不称取试样外，均按“试样液制备”步骤进行操作。

测定

气相色谱-质谱法测定条件

色谱柱：DB-5MS(30m× 0.25mm× 0.25um)石英毛细管柱或相当者；

载气：氦气，纯度≥99.999%；

流速：1，65mL/min；

进样口温度：250℃ ；

进样量：1uL；

进样方式：无分流(保持1min)进样；

柱温程序：初始55℃ ，保持1min，以25℃ /min速度升至280℃ ，保持6min；

NCI源：70eV；

离子源温度：150℃ ；

接口温度：280℃ ；

溶剂延迟：7min；

反应气：甲烷，纯度≥99.99%；

选择离子检测：

|| ||

定性测定

进行样品测定时，如果检出的色谱峰保留时间与标准样品相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且所选择的离子比与标准样品衍生物的离子比相一致(各相关离子比在相关标准品的1O%之内)，则可判断样品中存在氯霉素。

定量测定

吸取1uL衍生的试样液、标准液或空白液注入气相色谱-质谱联用仪中，以m/z 466为定量离子，标准工作液中氯霉素的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。根据试样液的峰面积，从标准曲线上查出溶液中对应的氯霉素浓度值。用标准工作曲线对试样进行定量，样品溶液中氯霉素衍生物的响应值均应在仪器测定的线性范围内。

在上述色谱条件下，氯霉素衍生物的参考保留时问为12.58min。氯霉素标准物质衍生物总离子流图和质谱图以及氯霉素标准物质衍生物选择离子质谱图参见附录中的图A.1、图A.2、图A.3。

平行试验

按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。

结果计算按式(1)计算样品中氯霉素的含量：

⋯ ⋯ ⋯ ⋯(1)

式中：

X 一试样中氯霉素的含量，单位为微克每千克(ug/kg)；

c —从标准工作曲线上查得试样液中氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

c0一从标准工作曲线上查得空白液中氯霉素的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；

V 一试样定容体积，单位为毫升(mL)；

m 一称取试样的质量，单位为克(g)。

结果取算术平均值，保留三位有效数字。

精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。1

附 录氯霉素标准物质衍生物的总离子流见图A1。

氯霉素标准物质衍生物的质谱图见图A2。

氯霉素标准物质衍生物的选择离子质谱图见图A3。