[科普中国]-肉与肉制品：维生素A含量测定

原理

样品皂化后，用石油醚提取不皂化的维生素 A，浓缩后，用高效液相色谱荧光检测器，激发波长340nm，发射波长460nm，分离测定维生素A，用标准外标法计算样品中维生素A的含量。

试剂除特别标明外所用试剂全为分析纯,所用水应为蒸馏水或同等纯度的水。
（1）氢氧化钾(GB 2306)：50%溶液；
（2）抗坏血酸：10%溶液；
（3）无水乙醇(GB 678)；
（4）石油醚：沸程 30～60℃；
（5）无水硫酸钠；
（6）异丙醇；
（7）甲醇(GB 683)：重蒸后使用；
（8）维生素A标准溶液：0.2mg/mL

称取维生素A标准品10.0mg，用异丙醇溶解，移至50mL棕色容量瓶中，用异丙醇稀至刻度。当天配制。

仪器和设备除实验室常规设备外，还需要以下设备：
（1）绞肉机：孔径不超过 4mm；
（2） 旋转蒸发器；
（3）液相色谱仪，带荧光检测器；
（4）色谱柱：十八烷基键合固定相柱或其他能分离维生素A的柱子。

试样按照如下方法试样：
（1）按 GB 9695.19 取样。
（2）取有代表性的试样200g，于绞肉机中至少绞两次使其混匀，试样应尽快分析。

分析步骤皂化维生素A易被光破坏，试验应避光操作。

称取0.5～5g试样于150mL棕色皂化瓶中，加入10%抗坏血酸溶液5mL，50%氢氧化钾溶液15mL，乙醇 30mL，混匀，于80℃水浴上回流加热30～60min，使试样溶液清澈，完全皂化后于流水中冷却。

提取将皂化后的试样溶液移入125mL分液漏斗中，用30mL石油醚分数次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中，塞上塞子，轻摇分液漏斗，避免乳化。静置，待分层后，将水层放入第二个分液漏斗中，醚层留在第一个分液漏斗中。于第二个分液漏斗中倒入10mL石油醚，进行第二次提取，如此进行3～4次，石油醚层交入第一个分液漏斗中。石油醚层反复用水洗涤，直至水层不呈碱性(用pH试纸检查)为止，弃去水层。将分液漏斗中石油醚层经过无水硫酸钠脱水，滤入干燥的棕色圆底烧瓶中。再用石油醚洗涤无水硫酸钠和分液漏斗，洗液并入棕色圆底烧瓶中

分析试样的准备将盛有石油醚提取液的圆底烧瓶与旋转蒸发器连接，于50～60℃水浴上减压回收石油醚，待瓶内只剩约1～2mL液体时，取下烧瓶，用氮气吹干剩余液体，立即加入2.0mL异丙醇溶液，摇匀，溶解瓶中维生素A，塞上塞子，以防溶剂挥发，此为色谱分析样液

测定（1）维生素A标准曲线的绘制

取维生素A标准溶液 1，2，3，4，5，6，7，8mL进行高效液相色谱(HPLC)分析，记录峰面积或峰高，以维生素A量为横坐标，峰高或峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

若样品中维生素A含量很低，可取维生素A标准溶液(0.2mg/mL)5mL，用异丙醇溶液定容至50mL容量瓶中，此标准溶液浓度为0.02mg/mL。如前进行高效液相色谱(HPLC)分析，绘制标准曲线。

（2）色谱分析参考条件

分析柱：十八烷基键合固定相柱式相同效用的柱；
流动相：甲醇/水98/2；
流动相流速：1 mL/min；
检测器：荧光检测器Ex:340nm；
Em：460nm；
进样量：试样液4～6μL，记录峰面积或峰高。

分析结果的计算
计算公式：X=A×1000×V0/V1×m×1000×100

式中：X——样品中维生素A含量，mg/100g；
A——根据试样的峰面积或峰高查标准曲线得到维生素A的量，μg；
V1——试样进样分析的体积，μL；
V0——试样最终稀释的体积，mL；
m——称样质量，g。
当符合允许差规定的要求时，取两次测定结果的算术平均值作为结果。

允许差同一样品同时或相继两次测定结果之差不得超过平均值的 30%1。