[科普中国]-表皮干细胞

表皮干细胞是一种具有产生至少一种以上高度分化子代细胞潜能的细胞。从发生机制来看年，干细胞并不直接分化产生终末分化细胞，而是先分化成短暂扩充细胞（transit amplifying cells），短暂扩充细胞有产生定向分化成某种终末分化细胞的能力，因而是定向祖细胞（committed progenitors）。

皮肤是人体最大的器官,在抵御微生物入侵、紫外线辐射及防止水分的丢失、调节体温上起重要作用，同时也是免疫系统的组成部分之一。除了这些生物学功能外，皮肤在维持人的外貌上还起十分重要的作用。出生后各种原因所致的皮肤损伤即使愈合也会留下不同程度的损伤，目前尚缺乏有效的治疗手段。而实际上皮肤是再生能力较强的组织，皮肤外层的表皮终身不断自我更新，其基底部的干细胞持续增殖分化以取代外层终末分化细胞，从而进行组织结构的更新，外层细胞的死亡脱落与基底干细胞的分裂维持一定的平衡，这是维持正常的组织结构和细胞内环境稳定的基本要求。因此，了解表皮干细胞如何增殖与分化及其调控机制对于促进损伤皮肤功能与结构的完全修复意义重大。

概念干细胞具有终身、无限的自我更新能力。短暂扩充细胞再经过几次到十几次不等的分裂后定向分化，进一步可分化为有丝分裂后细胞（post-mitotic cells）及终末分化细胞（terminally-differentiated cells）。短暂扩充细胞的存在说明组织靠较少量的干细胞分裂为很多的子代分化细胞[2]。干细胞自我更新和分化的方式通常有两种，一种是不对称方式分裂，即1个干细胞分裂成1个干细胞和一个定向祖细胞，常见于单细胞生物和无脊椎动物；另一种是具有高度调控机制的分裂方式，干细胞按一定的概率分裂成干细胞或定向祖细胞，即干细胞按一定的概率分裂为两个干细胞或两个定向祖细胞，或按不对称方式分裂,一般认为哺乳类动物即以此种方式进行自我组织更新。细胞的更新具有准确无误性，干细胞在整个增殖过程中处于相对静止状态，而由短暂扩充细胞完成DNA合成和细胞扩充的任务，干细胞在分裂后仍保留其原有的遗传信息，短暂扩充细胞拥有新复制DNA序列，以保证差错仅停留在短暂扩充细胞水平。通常干细胞等数分裂干细胞和定向祖细胞，当受到损伤等情况时，干细胞的分裂方式会发生改变以适应机体的需要[1，3]。

分裂周期表皮干细胞最显著的两个特征是它的慢周期性（slow cycling）与自我更新能力。慢周期性在体内表现为标记滞留细胞（label-retaining cell），即在新生动物细胞分裂活跃时参入氚标的胸苷，由于干细胞分裂缓慢，因而可长期探测到放射活性，如小鼠表皮干细胞的标记滞留可长达2年。干细胞的自我更新能力表现为在离体培养时细胞呈克隆性生长，如连续传代培养，细胞可进行140次分裂，即能产生1×1040个子代细胞[1，4]。此外，表皮干细胞还有一个显著特点是对基底膜的黏附。干细胞主要通过表达整合素（integrins）实现对基底膜各种成分的黏附。整合素是一种由1个α亚基、1个β亚基组成的的双亚基蛋白，不同的α亚基与不同的β基组成了多种整合素，其中由β1亚基组成的整合素在表皮干细胞与基底膜的黏附中起重要作用。各种整合素作为受体分子与基底膜各种成分相应的配体结合，如与层黏连蛋白结合的有整合素α1β1、α2β1、α3β1及α6β4，与纤维黏连蛋白结合的有整合素α3β1，与胶原结合的有整合素α2β1。干细胞对基底膜的黏附是干细胞维持其特性的基本条件。干细胞对基底膜的脱黏附是诱导干细胞脱离干细胞群落，进入分化周期的重要调控机制之一[5]。此外，目前体外分离、纯化表皮干细胞也是利用干细胞对细胞外基质的黏附性来进行的[6]。

数量干细胞通常处于静息状态，分裂缓慢，在形态学上表现为细胞体积小，胞内细胞器稀少，细胞内RNA含量低，在组织结构中位置相对固定。虽然各种实验对表皮干细胞的位置和数量报道不一，但一般认为毛囊隆突部（皮脂腺开口处与立毛肌毛囊附着处之间的毛囊外根鞘）含有丰富的干细胞。干细胞与短暂扩充细胞在表皮基底层呈片状分布，在没有毛发的部位如手掌、脚掌，表皮干细胞位于与真皮乳头顶部相连的基底层，其它有毛发的皮肤表皮干细胞则位于表皮脚处的基底层。表皮基底层中有1%～10%的基底细胞为干细胞，随着年龄的增大，表皮脚与真皮乳头逐渐平坦，表皮干细胞的数量也随之减少，这也是小儿的创伤愈合能力较成人强的重要原因之一[1，7]。

分化的调控干细胞的分化行为是被预先程序化还是受周围环境的调控一直是一个有争论的话题，但干细胞所处的微环境[又称为干细胞壁龛（niche）]对干细胞分化调控的影响是存在的[8]。干细胞的分化受细胞与细胞（包括间质细胞如成纤维细胞、肥大细胞等）、细胞与细胞外基质间相互作用的影响。细胞因子在传递细胞与胞外基质之间、细胞与细胞之间的信息中起重要作用，这些细胞因子包括白细胞介素（Ils）、干细胞生长因子（CSF）、表皮细胞生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、肝细胞生长因子（HGF）等。细胞与细胞间相互调控信息还可通过细胞间黏着连接的β连环蛋白（β-catenin）来传递。此外，细胞外基质成分的改变也影响干细胞的分化，整合素在其中起重要作用。当干细胞微环境发生改变如损伤时，胞外某些信息可通过整合素α5β1、αvβ5及αvβ6传递给干细胞，以触发跨膜信号转导，调控细胞的基因表达。这一过程不仅可以改变干细胞的分裂方式，而且也激活干细胞的多潜能性，使干细胞产生一种或多种定向祖细胞，以适应组织修复的需要。因此，整合素α5β1、αvβ5及αvβ6也被称为创伤愈合过程中的应急受体（emergency receptor）[4，8]。此外，表皮细胞在生长环境发生改变时可能会发生反分化。实验发现，将在体已不表达整合素而表达角蛋白K10的有丝分裂后细胞分离进行体外培养，这类细胞又可表现出显著的增殖能力，这与在创伤修复过程中已分化的基底层上部的表皮细胞可重新获得增殖能力相似[5]。

表皮干细胞脱离干细胞群落进入分化阶段的一个重要表现是通过c-myc诱导并伴随表面整合素水平的下降，细胞对基底膜脱黏附，因而整合素水平的表达及干细胞的黏附特性可能是维持干细胞群落所必需的条件。整合素调控多种细胞的分化，其中表皮细胞与胞外基质黏附能力的缺失是终止干细胞进行自我更新而进行终末分化的强刺激因素。将β1整合素缺失的小鼠胚胎干细胞与表达野生型β1整合素的细胞相比，发现野生型干细胞能分化出完整的表皮细胞谱系，而β1整合素缺失的干细胞则不能产生分化的细胞。同样，当细胞外基质不存在时也诱导干细胞及短暂扩充细胞的分化，使表皮干细胞退出干细胞群落。此外还有实验发现细胞外基质具有修饰β1整合素表达与激活的作用。因而各种损伤因素引起的细胞外基质变化都可对干细胞的生物学行为产生作用。丝裂原激活蛋白酶(MAPK)在β1整合素调控表皮干细胞增殖分化的信号转导通路中起重要作用。将结构域阴性的β1整合素的突变体转染到培养的人表皮形成细胞，以干扰其β1整合素的功能，降低β1整合素的黏附性，结果发现转染成功的表皮干细胞表面β1整合素水平及细胞与IV型胶原的黏附性明显降低，MAPK活性减弱，细胞的克隆形成能力下降，增殖潜能丧失，表现出短暂扩充细胞的特征。但通过超表达野生型β1整合素或激活MAPK则可上调整合素的表达，恢复其黏附性及增殖潜能[9]。

鉴别利用干细胞最显著的两个特征即慢周期性及自我更新能力来鉴定在体与离体干细胞是最基本且可靠的实验手段。由于干细胞的慢周期性，可采用标记滞留细胞的分析方法识别在体的静息干细胞。干细胞的自我更新能力在体外培养则表现为无限的增殖能力，形成细胞克隆，从而识别离体的干细胞。但这两种方法应用不方便，目前利用表皮干细胞一些相对特异的标志建立了一系列的表皮干细胞鉴别方法[1]。

由于表皮干细胞及短暂扩充细胞表面高表达β1整合素，而有丝分裂后细胞及终末分化细胞不表达β1整合素，因而可以用β1整合素的抗体来鉴别表皮干细胞及短暂扩充细胞。虽然表皮干细胞β1整合素的表达量约为短暂扩充细胞的两倍，但一般的光镜下尚不能依靠β1整合素阳性强度的不同来区分干细胞和短暂扩充细胞。如果利用激光共聚焦显微镜，将组织切片进行1μm的断层扫描，即在单层细胞水平上观察，则可以分辩出干细胞与短暂扩充细胞表达β1整合素阳性强度的差异[5，10]。

近来，有实验结合干细胞表面的α6整合素及另一个与增殖有关的表面标志10G7，可以区分干细胞与短暂分化细胞。检测发现α6阳性而10G7阴性（α6bri10G7dim）的细胞处于静息状态，在体外培养中具有很强的增殖潜能，证实为干细胞：而α6与10G7均阳性（α6bri10G7bri）的细胞是短暂扩充细胞，体外培养证实其增殖能力有限；α6阴性的细胞其角蛋白K10则呈阳性表达，说明是有丝分裂后终末分化细胞。因而可以利用α6整合素与10G7的单抗来区分干细胞、短暂扩充细胞和分化的表皮细胞[10]。

角蛋白（Keratins）是表皮细胞的结构蛋白，它们构成直径为10 nm的微丝，在细胞内形成广泛的网状结构。随着分化程度的不同，表皮细胞表达不同的角蛋白，因而角蛋白也可作为干细胞、定向祖细胞、分化细胞的鉴别手段。表皮干细胞表达角蛋白19（Keratin19,k19），定向祖细胞表达角蛋白5和14（Keratin5、Keratin14,K5、K14），而分化的终末细胞则表达角蛋白1和10（Keratin1、Keratin 10，K1、K10）。实验证实表皮基底层中K19与β1整合素表达均为阳性的细胞是标志滞留细胞，具有干细胞的慢周期性。一般认为毛囊的隆突部干细胞及胎儿、新生儿表皮基底层干细胞均表达K19，成人无毛发皮肤如手掌、脚掌部位基底层的干细胞K19表达阳性，但有毛发皮肤基底层中的表皮干细胞K19则表达为阴性[11，12]。又有实验发现毛囊隆突部表皮干细胞表达角蛋白15（Keratin15,K15），而且在干细胞的分化过程中，K15表达的减少较K19表达的减少更早，K15阴性而K19阳性的细胞可能是“早期”短暂扩充细胞，故K15可能较K19在鉴别毛囊的隆突部表皮干细胞更有意义[13]。

应用大面积Ⅲ度烧伤、广泛瘢痕切除、外伤性皮肤缺损以及皮肤溃疡等导致的严重皮肤缺损，特别是大面积Ⅲ度烧伤伤及皮肤全层及其附件，因而仅靠创面自身难以实现皮肤的再生，需要足够的皮肤替代物进行修复。临床常用的修复方法有自体游离皮片移植、皮瓣移植术，异体皮/异种皮移植术和人工替代物覆盖等方法。当大面积烧伤患者缺乏足够的自体皮片或因异体/异种皮免疫排斥反应而需再度植皮时。可利用皮肤再生能力强的特点，进行自体皮的培养并应用于创面覆盖。70年代中期体外培养表皮细胞就已经开始，培养的表皮细胞皮片是具有与在体表皮相似的生化、形态和功能特性的多层鳞状上皮。应用于创面的表皮细胞皮片的培养是在表皮细胞传递系统上进行的，表皮细胞传递系统是种植、支持、转运表皮细胞的三维支架，目前开发的表皮细胞传递系统有3T3细胞、聚乌拉坦、透明质酸、纤维蛋白胶与脱细胞真皮等。培养的皮片在体外及移植于创面后均保持有正常表皮的自我更新能力，即保留了干细胞自我更新与分化潜能的特性。正常情况下，大部分的表皮干细胞处于静息状态，只有部分干细胞脱离干细胞群落进入分化周期，维持皮肤的更新。由于体外培养条件下干细胞分化成短暂扩充细胞、有丝分裂后细胞以及终末分化细胞的过程也同样较为缓慢，因而目前用于自体移植皮片的培养周期最短也需两周。因此，尚需改变培养条件以缩短培养时间。此外，由于培养皮片仍存在表皮全层较薄，皮片抗拉力差、抗感染力弱以及费用较为昂贵等缺点，因而影响了培养皮片的临床使用[4，14]。

培养的表皮还用于异体移植，如应用于慢性溃疡与II度烧伤创面。移植的异体表皮细胞在创面能合成与分泌多种生长因子和细胞因子，刺激创面周围及底部残存的表皮细胞增殖、分化、移行。人们还在尝试将某些生长因子基因转染入表皮细胞用于创面移植，使其在创面释放足够的生长因子，促进创面愈合[4]。由于培养的表皮细胞II型HLA-DR为阴性，也没有起抗原提呈作用的Langerhans细胞，故不刺激宿主的免疫反应，因而可考虑作为深度创面如III度烧伤创面的永久覆盖物。在大鼠实验中，敲除培养表皮细胞的MHC，去除其免疫原性，可明显延长在全层创面的存活时间[15]。

由于皮肤干细胞终身存在，且干细胞的遗传信息可以传给子代细胞，因而干细胞不仅可以用来研究基因的作用以及某些疾病发病的基因机制，同时也可以用来对一些遗传性皮肤病进行基因治疗，包括导入标志性基因或一个异源基因，使细胞内原有基因过度表达（增加功能），或基因打靶（失去功能）以及诱导某个基因的突变等。如通过敲除表皮干细胞中的α6β4整合素基因，证实α6β4整合素不仅在稳定表皮细胞与基底膜的黏附中起重要作用，而且在基底细胞与胞外基质之间信号传递中起重要作用。此外，还发现一些遗传性疾病的基因机制，如表皮细胞编码整合素亚基α3、β3的基因突变，导致整合素表达异常，引起表皮与真皮的连接障碍，这是大疱性表皮松解症的重要病因之一[1，4]。

由于表皮的不断更新，必须对细胞进行基因转染以确保外源基因在表皮细胞的长期表达。为使外源基因在足够多的干细胞中表达，而不是在短暂扩充细胞中表达，需将表皮干细胞与短暂扩充细胞分离开，这是实现基因治疗的重要环节。尽管目前已成功将一些重组的基因引入表皮细胞，但大多数情况下，基因表达不超过4周，仅有少量报道能表达更长一些时间，而且表达的细胞不足基底细胞的1%，说明仅有很少的干细胞成功转染，因而要使干细胞基因转染成功，一种方法是使100%的基底细胞转染成功，以保证其中少量干细胞的成功转染；另一种方法是体外分离干细胞进行基因转染。人们常用第一种方法，但这种方法转染干细胞很少，第二种方法也十分困难，因为区分干细胞与短暂扩充细胞的方法尚未很好解决[1，16]。近来有文章报道能使转染率提高，基因表达超过12周，主要是较好地解决了干细胞的分离[17]。

在干细胞的研究领域中，造血干细胞的分化机制及临床应用研究进行得较为深入与全面，最重要的原因之一是造血干细胞及其分化的各系、各级子代细胞即造血干细胞分化的“时”、“空”上均有特异的细胞表面标志，容易进行细胞的鉴定与分离。而表皮干细胞的研究尚不深入的主要原因是尚未找到能反应细胞分化、代谢状况等精细变化特点的标志物，且缺乏分离、纯化表皮干细胞的技术手段和调控增殖与定向分化的各种体外培养体系等。只能寄希望于新技术的发展来研究内在调控机制及细胞外微环境对表皮细胞系分化的影响。

1.一种分离纯化皮肤表皮干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)首先将已脱离人或动物的皮肤，置于含青链素各500U/ml的生理盐水中带回实验室，在超净工作台上用生理盐水冲洗，去血污及毛发；2)在解剖镜下将皮肤与皮下组织分开，将皮肤切成0.1～0.2cm×0.1～0.2cm大小的虚，按上皮面朝上贴于直径为60mm玻璃平皿中，每皿3～4块，加培养基；所述培养基的配方为：90%Medium199+10%FBS+10μg/mlinsulin+10ng/mLLIF+1～1.5μg/mL氢化可的松+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素；3)置于CO2培养箱中培养，培养箱内的条件为5%CO2，饱和湿度，37℃；，每两天换液一次；4)经3～4天后，从组织块边缘长出上皮样细胞铺路石样生长，7～12天后，在上皮样细胞层上有小圆形细胞聚集呈克隆样生长，待这些克隆直径达约100～150μm时，在解剖镜下挑取这些克隆，用0.20%Trypsin处理，用玻璃针将这些细胞吸入铺有明胶的3.5cm塑料皿中，用无血清培养基培养；所述的无血清培养基的配方为：100%F12+(1%～1.2%)BSA+(20ng/mL～25ng/mL)EGF+5ug/mLInsulin+(15ng/ml～20ng/mL)IGF-1+20ng/mLLIF+0.05μg/mL氢化可的松+100U/mL青霉素+100U/mL链霉素；5)待细胞增殖达70～80%融合时，用0.2%Trypsin+0.02%EDTA进行消化，传代培养，即用上述无血清培养基将关中奶山羊表皮干细胞传25代冻存，或用上述无血清培养基将人类表皮干细胞传15代冻存；6)对所获得细胞进行当前同行公认的表皮干细胞分子标志的检测：