[科普中国]-炭黑曲霉

炭黑曲霉(Aspergillus carbonarius)属曲霉属黑色曲霉菌, 是葡萄中赭曲霉毒素 A(ochratoxin A, OTA)主要产生菌, 广泛存在于许多国家和地区的葡萄及其制品中, 是造成葡萄酒中 OTA 污染的主要来源。控制这些霉菌的生长与产毒是从源头上减少葡萄原料及其制品 OTA 污染的关键环节

炭黑曲霉菌株在查氏琼脂上生长迅速， 25℃7天直径40-60mm，平坦；菌落在麦芽汁琼脂上生长迅速, 25℃7天直径达70-75mm，平坦；质地丝绒状或在边缘，近边缘处有较多的气生菌丝；分生孢子结构大量，或仅中部较多，孢子头黑色；无渗出液；无气味或轻霉味；菌落反面呈不同程度的黄褐色。

炭黑曲霉概述炭黑曲霉(Aspergilluscarbonarius)属曲霉属黑色曲霉菌,是葡萄中赭曲霉毒素A(ochratoxinA,OTA)主要产生菌,广泛存在于许多国家和地区的葡萄及其制品中,是造成葡萄酒中OTA污染的主要来源。控制这些霉菌的生长与产毒是从源头上减少葡萄原料及其制品OTA污染的关键环节,有关炭黑曲霉的污染规律及其控制方法方面的研究成为近年来的国际研究热点。根据已有研究,紫外线照射、杀菌剂、二氧化硫、纳他霉素、多酚、香精油、天然提取物和挥发性化合物等都能够在一定条件下对炭黑曲霉的生长与产生OTA的能力产生一定的抑制作用。最新研究发现,酵母、细菌和一些非产毒真菌及其代谢产物也对炭黑曲霉的生长和OTA产生具有良好抑制作用,而且具有无毒无害,安全性好等优点,在实际应用中展示出很好的应用潜力,越来越受到相关科研工作者和应用者的重视1。

形态特征菌落在查氏琼脂上生长迅速，25℃7天直径40-60mm，平坦；质地丝绒状，有的菌株有较多的气生菌丝；分生孢子结构大量，有时在边缘处或近边缘处较少，孢子头纯黑色；具少量无色渗出液或无；稍具不明显的霉味；菌落反面淡黄色至黄褐色，或在中部呈黄褐至黑褐色。分生孢子头初为球形，直径100-300（-500）μm，老时分裂成几个圆柱状结构，直径可达1000μm或更大；分生孢子梗发生于基质，孢梗茎2000-4500×20-30（-40）μm，无色透明，老时近顶囊部分带黄色或淡褐色，壁平滑；顶囊球形或近球形,直径70-80（-120）μm,老时带褐色，全部表面可育；产孢结构双层：梗基在一定时间范围内随着菌龄的增加而增大，通常20-50μm×（5-）7-13μm，大者可长达80μm，老时呈褐色；瓶梗8-12（-15）μm×3-6（-8）μm；分生孢子球形、近球形，直径6-9μm，壁显著粗糙，老后呈尖疣状或疣状。文献报道（Raper&Fennell，1965）偶尔产生菌核，我们的菌株中未见。

菌落在查氏酵母膏琼脂上生长更为迅速，25℃7天直径70-75mm，平坦或在近边缘处有辐射状沟纹；质地丝绒状，有的菌株在边缘或近边缘处有较多至大量的气生菌丝；分生孢子结构大量，或仅中部较多，黑色；无渗出液，无气味或轻霉味；菌落反面呈不同程度的黄褐色，或中心呈红褐色。

菌落在麦芽汁琼脂上生长迅速,25℃7天直径达70-75mm，平坦；质地丝绒状或在边缘，近边缘处有较多的气生菌丝；分生孢子结构大量，或仅中部较多，孢子头黑色；无渗出液；无气味或轻霉味；菌落反面呈不同程度的黄褐色。

生境土壤、柿饼、植物根、霉果、牛粪。37℃生长。

炭黑曲霉的分布中国分布北京（AS3.3558）；福建厦门（MQ10075）；湖南长沙（MQ2233）；广西桂林（MQ1038）；云南保山（C6030）、景洪（C7663）、瑞丽（C6840）；甘肃兰州（MQ6622）；地点不详（AS3.322）。

我国文献报道的分布还有河北、四川，基物是粪肥和酒曲（戴芳澜，1979）；台湾台北和嘉义，基物是贮存稻米、土壤和腐叶（Tzeanetal．，1990）。

本种分生孢子头炭黑色，分生孢子大，可达9μm，壁显著粗糙，特征明显，易于与组内其他诸种区分。

世界分布加纳、印度、印度尼西亚、日本、新喀里多尼亚、尼日利亚、南非、美国等。

炭黑曲霉产生OTA的能力从微生物分类而言,炭黑曲霉属真菌界、真菌门、半知菌亚门、半知菌纲、壳霉目、杯霉科、曲霉属微生物,属黑色曲霉(AspergillusSectionNigri),能够污染葡萄、谷物、咖啡、可可和花生等食品基质,其中从葡萄中分离到的炭黑曲霉数量最多,报道也最多。从葡萄和可可中分离到的炭黑曲霉OTA产量最高,可达195000μg/L;而从谷物和花生中分离到的炭黑曲霉OTA产生能力较低。

炭黑曲霉可在麦芽汁琼脂培养基(maltagarmedium,MEA)、酵母提取物培养基(yeastextracts,YES)、查氏酵母膏琼脂培养基(czapekyeastextractagar,CYA)、土豆葡萄糖琼脂培养基(potato-dextroseagar,PDA)和合成培养基(syntheticnutrientmedium,SNM)等多种培养基上生长并合成OTA毒素,以YES和CYA培养基中OTA产量最高。其中,SNM培养基是用来模拟葡萄汁中营养成分的一种培养基。同时,炭黑曲霉也可以在谷物、玉米、葡萄、葡萄干和可可豆等多种食品中生长,并产生OTA。Jiang等研究发现,炭黑曲霉也可在不同的鲜食葡萄品种上进行生长与产毒,其中以在无核白葡萄上的侵染速度最快,OTA产量最高。

抑制炭黑曲霉生长与OTA产生的方法国外有关炭黑曲霉生长和OTA产生的抑制方法可以归纳为3种:物理方法、化学方法和生物方法。国内有关这方面的研究较少且多为文献综述,研究内容主要为OTA的生物去除和降解。不过,随着人们食品安全意识的提高,如何利用高效、天然、无毒无害的抑菌剂来控制食品原料和加工过程中的炭黑曲霉的生长与产毒,已经成为近年来国内外的研究热点。

物理方法研究发现,采用紫外线照射可以有效抑制炭黑曲霉的生长与产毒。Garcia-Cela等发现,紫外线A(UV-A)和B(UV-B)对炭黑曲霉的菌落形态(直径、物质干重和菌落密度)和OTA产量都会产生显著影响,而且其影响程度在不同菌种间有所差异。其中,照射时间由16h减少到6h时,炭黑曲霉的生长量显著减小,但OTA产量不变;UV-A照射时,OTA的降低量大于UV-B照射,而且其降低量随照射时间的延长而减少,UV-B照射下的菌落颜色会发生改变。g-射线辐照也可抑制炭黑曲霉的生长与OTA的产生,人为添加炭黑曲霉的葡萄干用辐照量为10.0kGy的g-射线处理后,培养12d时葡萄干中未检测到OTA2。

化学方法有关化学法抑制炭黑曲霉生长和OTA产生的方法主要包括杀菌剂、二氧化硫、纳他霉素、多酚、香精油和挥发性化合物等。

（1）杀菌剂

杀菌剂主要用于葡萄采前和田间葡萄园内病虫害的防治。研究发现,

将葡萄果粒在采摘前用杀菌剂处理后,炭黑曲霉的侵染比例显著降低,OTA产量下降。Belli等考察了26种杀菌剂对炭黑曲霉生长和OTA产生的影响,结果发现,9种杀菌剂均可显著降低炭黑曲霉的生长速率,13种杀菌剂可以完全抑制炭黑曲霉的生长;能够完全抑制炭黑曲霉生长的杀菌剂均可抑制OTA的产生;但只能部分抑制炭黑曲霉生长的杀菌剂不能抑制OTA的合成,只有含铜或甲氧基丙烯酸酯类的杀菌剂,才能同时抑制炭黑曲霉的生长与OTA合成;而含硫的杀菌剂反而会对炭黑曲霉的生长和OTA产生有促进作用。多菌灵能够显著抑制炭黑曲霉的OTA产生,但不影响其菌体生长。咪唑类杀菌剂,可以控制炭黑曲霉生长,但不抑制OTA产生。

（2）二氧化硫

二氧化硫(SO2)对各种微生物都具有杀灭作用。其作用机制主要有两方面:一是SO2对微生物有很强的毒性和诱变效应,可使微生物的mRNA失活,也可与蛋白质的二硫键发生反应;其次,SO2对细胞膜有毒害作用。不同SO2产品的毒性差异较大,以亚硫酸(H2SO3)形式提供的SO2毒性最大,其次为亚硫酸氢盐(HSO3−)和亚硫酸盐(SO32−)。研究发现,焦亚硫酸钠可以显著抑制炭黑曲霉的孢子萌发、菌丝生长和OTA产生,但其所需浓度不同。Pateraki等研究发现,葡萄汁培养基中的焦亚硫酸钠浓度高于500mg/L时,可以抑制炭黑曲霉的孢子萌发、菌丝生长和OTA产生。Ioannidis等研究发现,焦亚硫酸钠可延长炭黑曲霉的延滞期,在浓度为50mg/L时对炭黑曲霉没有抑制作用;但在较高浓度(100mg/L和150mg/L)下会抑制炭黑曲霉的生长;在200mg/L时可完全抑制炭黑曲霉生长。SO2保鲜剂可以用作抑制葡萄贮藏过程中炭黑曲霉生长的抑制剂,在浓度为0.4mg/L时葡萄表面的真菌菌落数量明显低于对照,且形成的菌落不能产生孢子。

（3）纳他霉素

纳他霉素(natamycin),是由纳塔尔链霉菌(Streptomycesnatalensis)发酵得到的一种食品防腐剂。它能与真菌的麦角甾醇以及其它甾醇基团相结合,阻遏麦角甾醇的生物合成,从而使细胞膜发生畸变,最终导致细胞质渗漏,引起细胞死亡。Medina等发现,50~100ng/mL的纳他霉素可有效抑制炭黑曲霉的生长和OTA产生。但Kogkaki等研究发现,纳他霉素对炭黑曲霉菌体的生长速率没有显著影响,对第10d和15d时炭黑曲霉的OTA产量有降低作用,在浓度较高(800~1000ng/mL)时才会对菌体生长产生显著抑制作用。

（4）多酚类化合物

葡萄和葡萄酒中富含多酚类化合物,如没食子酸、香草酸、原儿茶酸、儿茶素、咖啡酸、绿原酸和白藜芦醇等。近年来研究发现,这些酚类化合物对炭黑曲霉的菌体生长和OTA产生有一定抑制作用,但其抑制效果会因霉菌和酚类物质的种类不同而有所差异。香草酸和4-羟基苯甲酸可抑制大部分OTA产生菌的生长与产毒,但不能抑制炭黑曲霉和赭曲霉(A.ochraceus)的生长与产毒。没食子酸可抑制炭黑曲霉的菌体生长,延长其延滞期,减少其OTA产量,并能在500mg/L浓度下,完全抑制炭黑曲霉的生长。咖啡酸、香豆酸和阿魏酸则在0.30~1.10g/L的浓度范围内对炭黑曲霉的生长没有显著影响,但香豆酸和阿魏酸可降低炭黑曲霉的OTA合成,并在0.65mg/mL时降低炭黑曲霉中聚酮合酶(AcOTApks)和非核糖体多肽合成酶(AcOTAnrps)的基因表达量。低浓度的白藜芦醇对炭黑曲霉生长没有显著影响,高浓度时可抑制霉菌的OTA产生。当葡萄中白藜芦醇含量在真菌侵染之前已经达到较高水平时,也能有效控制OTA的合成。然而,如果白藜芦醇浓度在真菌侵染之后(40h)才有所提高,则不能抑制OTA的合成。另外,一些其他抗氧化剂如甲萘醌(menadione)和3,5-二叔丁基-4-羟基甲苯(BHT)也会对炭黑曲霉的生长、活性氧(ROS)和OTA产生有一定的抑制作用;其中,甲萘醌在浓度高于20µmol/L时,能显著降低炭黑曲霉的生长速率,但会提高其OTA产量和ROS水平;BHT在浓度为2.5~10mmol/L时,则可提高OTA产量和ROS水平;只有当BHT浓度高于5mmol/L时,才能抑制炭黑曲霉的生长。

生物方法生物控制方法主要是利用酵母菌、细菌和真菌及其代谢产物对炭黑曲霉的生长和OTA产生进行抑制,因其具有高效、安全和环保等特点,具有广阔的应用前景,也得到了研究者们越来越多的重视与报道。

（1）酵母

能够抑制炭黑曲霉生长和OTA产生的酵母主要有 酵母菌(Saccharomycescerevisiae)和非酿酒酵母菌(non-Saccharomyces)。Armando等发现,酿酒酵母菌RC008和RC016可显著降低炭黑曲霉的生长速率和OTA产生。Cubaiu等研究发现,酿酒酵母菌DISAABA1182在体内(invivo)和体外(invitro)实验中对炭黑曲霉和赭曲霉(A.ochraceus)均有抑制作用,且其去菌体发酵液可完全抑制两株霉菌的生长与OTA产生。当两株霉菌与酿酒酵母菌的活细胞或其去菌体发酵液共培养时,可显著降低霉菌中pks基因的表达水平。一些来自于酿酒葡萄果实和植株的非酿酒酵母菌,也可以显著抑制炭黑曲霉的生长和OTA产生。目前已经报道的能够显著抑制炭黑曲霉生长和OTA产生的酵母菌主要有东方伊萨酵母菌(Issatchenkiaorientalis)和耐热克鲁维酵母菌(Kluyveromycesthermotolerans。Fiori等分析了两株非酿酒酵母菌(Cyberlindnerajadinii273和Candidafriedrichii778)和两株低发酵性酵母菌(Candidaintermedia235和Lachanceathermotolerans751)对炭黑曲霉的抑制作用,及其对葡萄汁中OTA的去除能力。结果发现,其中两株菌对炭黑曲霉的生长有明显的抑制作用,但其过滤物和无菌培养液都不能有效抑制霉菌生长,4株酵母菌的挥发性产物均能够持续抑制病原菌的生长,1株酵母菌的非发酵性产物也能有效抑制炭黑曲霉的营养生长,而且这4株酵母菌均能有效吸附葡萄汁中OTA,且灭菌处理能够提高4株菌对OTA的吸附能力。

（2）细菌

利用细菌抑制炭黑曲霉生长和产毒的研究报道相对较少。Ngang等发现,从可可发酵液中分离到的乳酸菌A19和A21对OTA产生菌有很好的抑制活性,抑制率为15%~66.7%,其发酵液过滤物经100℃处理后的抑菌活性降低,表明其抑菌活性物质为蛋白类,可能为细菌素。乳酸菌A19作为可可发酵启动剂时,可显著降低炭黑曲霉和黑曲霉的数量,OTA含量也基本降为0。枯草芽孢杆菌及其发酵液也能显著抑制炭黑曲霉的生长和OTA产生。

（3）真菌

葡萄、土壤和其他分离源中的不产毒素的真菌对炭黑曲霉的生长和产毒也有一定的抑制作用,其抑制程度与所用菌种有关。Ahmed等发现,Penicilliumadametzioides对葡萄采前的OTA产生菌污染有一定抑制作用。灰霉(Botrytiscinerea)是葡萄表面主要的污染真菌之一,当其与炭黑曲霉在SNM培养基中共同培养(pairedculture)时可显著抑制后者的OTA产生,这与Kogkaki等的研究结果一致;而且灰霉菌可以降解SNM培养基中的OTA,降解率为24.2%~26.7%3。

本词条内容贡献者为:

梁志宏 - 副教授 - 中国农业大学