[科普中国]-米酵菌酸

米酵菌酸（Bongkrekic acid，BA）是由椰毒假单胞菌属酵米面亚种产生的一种可以引起食物中毒的毒素。食入该毒素污染的食物可引起人或动物中毒,重者可致死亡。米酵菌酸是发酵玉米面制品、变质鲜银耳及其它变质淀粉类制品是引起中毒的主要原因。

简介米酵菌酸，化学名为：3-羧甲基-17-甲氧基-6，18，21-三甲基-廿二碳-2，4，8，12，14，18-七烯二酸。20世纪30年代国外从引起人中毒的椰子发酵食品样品中提取出该毒素，并对该毒素的理化性质和致毒机制进行了大量研究，近年来米酵菌酸又作为研究抗肿瘤疾病和细胞凋亡的一种工具试剂来使用。我国70年代从酵米面中毒样品中分离出一种称为“酵米面黄杆菌”(Flavobacterium farinofermen-tans no sp)的食物中毒菌，其产生的外毒素-酵米面黄杆菌毒素A(简称黄杆菌毒素A,flavotoxin A)现证明即为米酵菌酸1。

米酵菌酸的毒性BA作为酵米面中毒和银耳中毒的病原菌产生的毒素之一,具有很强的生物活性,是椰毒假单胞菌引起食物中毒和死亡的主要毒性代谢产物。临床症状表现为恶心呕吐、腹痛腹胀等,重者出现黄疸、腹水、皮下出血、惊厥、抽搐、血尿、血便等肝脑肾实质性器官损害症状。动物实验亦表明,BA主要作用于肝、脑和肾等实质性脏器且以细胞内的线粒体最为敏感。国外有研究表明BA作用于胰腺β细胞抑制葡萄糖引起的电活性而造成高血糖,此后又可转为低血糖,严重者出现低血糖昏迷。BA除对线粒体有破坏作用外,还可使部分巯基酶失活,因此解毒时可使用L-半胱氨酸等巯基化合物恢复由BA所抑制的巯基酶活性，减轻或解除BA的毒害。此外BA具有抑菌作用,对霉菌、酵母及某些细菌均有强烈的抑制和杀灭作用,12.5μg量的BA即可在平板上形成明显的抑菌圈1。

米酵菌酸引起的食物中毒1. 污染的食物种类米酵菌酸是发酵玉米面制品、变质鲜银耳及其它变质淀粉类制品是引起中毒的主要原因，常见的食品有糯米面汤圆、吊浆粑、小米或高粱米面制品、马铃薯粉条、甘薯淀粉等。椰毒假单胞菌酵米面亚种食物中毒多发生在夏、秋季节。潮湿、阴雨的天气，再加上储存不好，椰毒假单胞菌在食物中大量地生长繁殖，吃了这种食物就会发生中毒。米酵菌酸耐热，一般烹调方法不能破坏其毒性，但日晒两日后可去除94%以上变质银耳中的毒素。

2. 中毒表现进食后2~24小时出现上腹不适，恶心、呕吐（呕吐为胃内容物，重者呈咖啡色样物），轻微腹泻、头晕、全身无力等。重者可出现皮肤黄染、肝脾肿大、皮下出血、呕血、血尿、少尿、意识不清、烦躁不安、惊厥、抽搐、休克等，体温一般不升高，病死率高达40%~100%。

3. 急救措施立即手法或药物催吐，催吐后口服活性炭，并尽快到医院治疗。凡与患者吃过同种食物的人，不论是否发病，一律送往医院观察、治疗。

4. 中毒预防严禁用浸泡、霉变的玉米制作食品。家庭制备发酵谷类食品时要勤换水，保持卫生，要保证食物无异味产生，最好的预防措施是不制作、不食用酵米面。禁止出售发霉变质的鲜银耳。学会正确辨别银耳的质量。正常干银耳水泡发后，朵形完整、较大，菌片呈白色或微黄，弹性好，无异味；变质银耳不成形、发黏、无弹性，菌片呈深黄至黄褐色，有异臭味。发好的银耳要充分漂洗，食用前要摘除银耳的基底部。

米酵菌酸的中毒机制BA的毒性最早认为是干扰糖代谢,以后人们一直研究其机制。1959年Welling等通过动物试验发现BA可抑制丙酮酸、α-酮戊二酸和苹果酸的氧化,对磷酸化过程的抑制更为明显。1970年Henderson以大鼠线粒体为材料证明了对氧化磷酸化的抑制部位不在呼吸链,而是线粒体膜上的ADP转运过程。Weidemann发现BA增加ADP与线粒体内膜的亲合力,阻断ADP转运。Lauquin则证明BA在线粒体内膜上与ADP载体形成复合物。于是吴洪娟等认为由于BA与腺嘌呤载体ANT(电压依赖性阴离子通道)的结合,成为ANT的特异性非竞争性抑制剂，阻碍了ADP与ATP在线粒体内膜的交换,使ATP生成减少或消失;由于缺乏ATP,细胞膜上的离子泵不能发挥正常功能而效率低下,引起细胞内水钠潴留,细胞水肿；线粒体内膜依赖ATP的机制停止工作,造成水钠潴留,从而引起线粒体肿胀,嵴变短、模糊直至消失。作为细胞内进行呼吸作用和能量交换的重要场所及细胞内主要的供能器官—线粒体,它的功能消失必将导致细胞、机体的死亡。1

食品中米酵菌酸的测定方法1. 国标法GB 5009.189《食品安全国家标准 食品中米酵菌酸的测定》2

（1）原理

试样经提取、净化、浓缩及过滤后,经高效液相色谱仪分析,外标法定量。

（2）材料

固相萃取柱:阴离子交换柱(60mg/3mL)或等效品,临用前依次加5.0mL甲醇和5.0mL水活化,保持柱体湿润。

米酵菌酸:纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

（3）标准溶液配制

米酵菌酸标准储备液(0.1mg/mL):准确称取米酵菌酸标准品1mg(精确至0.01mg),用甲醇溶解,转移至10mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。置于2°C~8°C冰箱中避光保存,有效期为6个月。

米酵菌酸标准系列工作液:分别吸取米酵菌酸标准储备液用甲醇稀释定容,配制成米酵菌酸浓度分别为0.3μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、40.0μg/mL的标准工作溶液。临用时配制。

（4）分析步骤

A.固相萃取法：

提取：干试样经粉碎过φ0.425mm筛后,称取20g(精确至0.01g)置于锥形瓶中,加入100mL甲醇-氨水溶液;鲜(湿)试样经剪碎、匀浆后称取10g(精确至0.01g),加入80mL甲醇-氨水溶液。混匀,室温下避光浸泡1h,置于超声波振荡器中超声提取约30min,过滤。干试样取滤液50mL,鲜(湿)试样取滤液40mL。置80°C水浴中浓缩至约3mL,待净化。

净化：将浓缩后的试样全部转移到已活化的固相萃取柱中,依次用5mL水和5mL甲醇淋洗,弃去流出液,抽干萃取柱,再用6mL甲酸-甲醇溶液(2%)洗脱,收集洗脱液,于40°C±0.5°C水浴中氮吹至干,然后加入0.5mL甲醇,涡旋溶解,混匀,经微孔有机滤膜过滤后进行HPLC分析。

B.液-液萃取法

提取：干试样经粉碎过φ0.425mm筛后,称取20g(精确至0.01g),置于具塞锥形瓶中,加入20mL甲醇,室温下避光浸泡1h,再加入80mL三氯甲烷和0.2mL磷酸溶液(45.4%);鲜(湿)试样经剪碎、匀浆后称取10g(精确至0.01g),加入16mL甲醇,于室温下避光浸泡1h,再加入64mL三氯甲烷和0.16mL磷酸溶液(45.4%)。振荡30min,过滤,干试样取滤液50mL,鲜(湿)试样取滤液40mL。

萃取：将上述滤液分别移入150mL分液漏斗中,加入与滤液等体积的碳酸氢钠溶液(40g/L),振摇2min,静置待分层后,取出下层于另一分液漏斗中;再用碳酸氢钠溶液(40g/L)10mL重复提取两次,轻摇;将三次提取的碳酸氢钠溶液合并,加入25mL三氯甲烷,振摇2min,静置分层后弃去三氯甲烷,于分液漏斗中慢慢加入盐酸溶液(6mol/L)调该溶液pH至2~3,加入石油醚50mL(鲜、湿试样为40mL),振摇3min,静置分层,取出石油醚层于旋蒸瓶中,再分别用石油醚30mL和20mL各提取一次(鲜、湿试样两次均为20mL),将石油醚层并入同一瓶中,于40°C±0.5°C水浴中旋蒸浓缩至干,用少量甲醇分次将旋蒸瓶中提取物溶解并转移至5.0mL玻璃离心管或浓缩瓶中,于40°C±0.5°C下氮吹浓缩至干,然后加入0.5mL甲醇,涡旋溶解,混匀,经微孔有机滤膜过滤后进行HPLC分析。

（5）色谱参考条件

色谱参考条件列出如下:
a) 色谱柱:C18色谱柱(柱长250mm,内径4.6mm,粒度5μm)或同等性能的色谱柱;b) 流动相:甲醇+水=75+25,水用冰乙酸调pH 至2.5;
c) 流速:1.0mL/min;
d) 柱温:30°C;
e) 检测波长:267nm;
f) 进样量:20μL。

（6） 标准曲线的制作
分别将 20μL米酵菌酸标准系列工作液注入液相色谱仪中,测定相应的峰面积,以标准工作液的浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,绘制标准曲线。米酵菌酸标准溶液的色谱图见图 A.1。5.4 试样溶液的测定将试样溶液注入液相色谱仪中,以保留时间定性,同时记录峰面积,根据标准曲线得到待测液中米酵菌酸的浓度。

（7）分析结果的表述试样中米酵菌酸含量按式(1)计算:

X=（ρ×V×2）/m..............................(1)

式中:
X ———试样中米酵菌酸的含量,单位为微克每克(μg/g);

ρ ———由标准曲线得到的试样溶液中米醇菌酸的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);V ———试样溶液的浓缩定容体积,单位为毫升(mL);
2 ———稀释倍数;

m ——— 试 样 质 量 ,单 位 为 克 (g)。计算结果保留两位有效数字。

（8）精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

（9）其他

方法检出限为0.005μg/g,定量限为0.015μg/g。

2. 超高效液相色谱串联质谱法利用超高效液相色谱串联质谱法测定银耳中的米酵菌酸。样品采用甲醇提取，混合强阴离子交换固相萃取柱(PAX)净化，UPLC BEH C(2.1×100 mm，1.7 μm)色谱柱分析，以 10 mmol/L 乙酸铵-乙腈为流动相，梯18度洗脱，串联四级杆质谱多反应监测负离子模式检测，基质匹配外标法定量。结果表明，米酵菌酸在 1.6 μg/L~80 μg/L 线性范围内，相关系数(r)0.999 9，检出限 0.5 μg/kg，加标回收率 82 %~102 %，相对标准偏差 RSD≤8.5 %。该方法快捷准确、灵敏度高，可用于银耳中米酵菌酸的确证方法3。

3. 其他测定方法液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱-二极管阵列检测器结合固相萃取法等新型方法4。

本词条内容贡献者为:

梁志宏 - 副教授 - 中国农业大学