[科普中国]-定量PCR

定量PCR，又称定量即时聚合酶链锁反应（Quantitative real time polymerase chain reaction，简称 Q-PCR/qPCR/rt-qPCR、定量即时PCR、即时定量PCR），是一种在DNA扩增反应中，以萤光染剂侦测每次聚合酶链锁反应（PCR）循环后产物总量的方法技术，有广义概念和狭义概念。广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果（扩增效率为零）。

定量原理实时荧光定量PCR是利用荧光信号的变化，实时检测PCR扩增反应中每次循环扩增产物量的变化，通过循环阈值和标准曲线的分析对标本中起始模板拷贝数进行定量分析。在实时荧光定量P(R进程中，每次循环进行一次荧光信号的收集，以荧光强度为纵轴，循环次数为横轴，所得到的曲线称为PCR扩增曲线(图1)。在前面十多次循环中，虽然目标产物呈指数增加，但其引发的荧光总强度未达到仪器的检测限，所以仪器检测到的荧光强度无变化，该时间段荧光强度的平均值称为基线。当荧光信号达到一定强度后，荧光强度的増加才能够如实地被检测仪器检测到。能够被仪器检测到的最小荧光强度称为荧光阈值，图中荧光阈值为0.11。实际情况下，荧光阈值可人为设定，通常取第3~15次循环的荧光强度均值加10倍标准差，也可采用阴性对照荧光值的最高点。PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数称为循环阈值，图1中Ct1、Ct2、Ct3分别为三个样品的循环阈值。

Ct值与反应管内的模板量(拷贝数)相关，与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始拷贝数越多，Ct值越小。采用已知起始拷贝数的模板，在相同条件下进行扩增，测得其Ct值，以Ct值为纵坐标，起始模板拷贝数的对数值为横坐标，制作标准曲线。对于模板量未知的样品，只要在相同条件下测得其Ct值，即可从标准曲线上査出该样品的起始拷贝数的对数值，进而换算得到样品中的模板拷贝数。1

分类根据引入荧光标记的类型，常用的实时荧光定量PCR有如下几种：SYBR Green法、水解探针法( TaqMan法)、杂交探针法以及分子信标法等。

1、SYBR Green法

SYBR Green是一种荧光染料，在PCR的反应体系中加入过量 SYBR Green荧光染料，该染料特异性地掺入DNA双链后，发出荧光信号，而未掺入链中的SYBRGreen染料分子不发出任何荧光信号。PCR产物越多，荧光越强，荧光信号的增加与PCR产物的增加同步。由于只有退火和延伸时才形成双链DNA，SYBR Green染料才会结合到双链DNA而发出荧光信号，因此荧光信号的采集应该在这两个阶段进行SYBR Green法可以用于各种扩增产物的定量，只要最后产物是双链DNA。这既是SYBR Green法的主要优点，也是主要缺陷，即SYBR Green法不能区分扩增产物的特异性，只要是双链DNA，或者单链核酸中存在部分双链结构，结合SYBR Green后都会发出荧光信号。为了克服该缺陷，可配合PCR产物熔解曲线的分析：如果熔解曲线得到单一峰，一般认为无非特异性扩増，用该方法定量准确；如果熔解曲线岀现杂峰，提示以此定量不准确。

2、TaqMan法

TaqMan法使用TaqMan探针与扩增产物中的靶基因序列杂交，从而提高产物检测的特异性，即使扩增产物中存在非特异性扩增片段，只要不与探针互补结合，就不会对荧光定量产生影响。TaqMan探针序列与扩增目的片段的一段互补，5′端标以荧光报告基团，3端标以荧光淬灭基团。TaqMan探针的3′端经过磷酸化处理，可防止探针在PCR扩増过程中被延伸。当探针保持完整时，荧光报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，报告基团的荧光信号不能被检测到；当荧光报告基团与淬灭基团发生分离，荧光报告基团发出的荧光信号就能被系统检测到。可用于标记TaqMan探针的荧光报告基团有羧基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)、羧基-4，5-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素(JOE)、六氯荧光素(HEX)等；淬灭基团有5-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)和4-(4′-二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYI)。在PCR退火时，引物和探针均可结合到靶基因模板上；在延伸阶段，随引物延伸。Taq酶沿DNA模板移动，当移动到TaqMan探针位置时，Taq酶利用其5-3外切酶活性水解切断探针，释放出荧光报告基团，使荧光报告基团与淬灭基团分离，淬灭作用被解除，荧光报告基团释放荧光信号(图4-5)。每次循环新增的荧光信号与靶序列数量一致

TaqMan法需要利用Taq酶的5′~3外切核酸酶活性，在延伸过程中水解探针释放荧光信号。在60℃时，Taq酶的5′→3′外切核酸酶活性最高，因此TaqMan法一般采用60℃延伸。设计引物与探针时，应使探针与模板结合部位尽量靠近引物与模板结合的部位，探针的T值要适当高于引物的TM值，通常高5℃左右，以保证探针与模板结合的稳定程度大于引物与模板结合的稳定程度。探针的TM值最好为68~70℃长度小于30bp；5端不能有碱基G，因为G可能会淬灭荧光素。为了使检测结果更准确可靠，需要对引物、探针、PCR其他要素以及扩增循环条件进行优化。

与SYBR Green法相比，TaqMan法的优势在于特异性高，探针设计相对简单，重复性比较好；其缺点是一个探针只适合检测一个特定的靶序列，且由于探针在反应过程中被水解，为保证探针足够，需在体系中加入较多探针，导致成本增加，且本底荧光值较高(淬灭不彻底)。为解决 TaqMan探针本底荧光值高的问题，科学家在传统TaqMan探针基础上设计了一种新型探针-TaqMan MGe探针。MGB意为小沟结合物( Minorgroove binder)，能与DNA双螺旋的小沟结合。 TaqMan M(B探针中的MGB连接于探针的3′端，可折叠伸进由探针末端5或6个核苷酸形成的小沟，提髙探针的T。值使探针与模板的杂交稳定性大大提髙，使较短的探针同样能有较髙的T值，而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，本底荧光值更低。除增加MGB分子外，TaqMan MGB探针与传统的 TaqMan探针的不同之处还在于其3端的淬灭基团为非荧光性基团，其吸收荧光报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。

3、双杂交探针法

双杂交探针是根据荧光共振能量转移原理设计的。该法反应体系中有2条特异性探与靶序列互补结合后几乎首尾相连，探针1的3′端与探针2的5端相隔1~5个核苷酸。在探针1的3′端、探针2的5端分别标记荧光供体基团和荧光受体基团。在退火阶段探针与模板杂交时，两种探针互相靠近，实现荧光共振能量转移。荧光供体基团接受激发，并将得到的能量传给荧光受体基团，使其发射特定波长的荧光，被系统检测到。只有当两条探针都与靶序列正确杂交时才可能检测到荧光受体基团的荧光信号，因此，该方法本底荧光值更低，特异性更高。荧光信号的采集应在退火后进行。双杂交探针法工作原理如图3所示。

4、分子信标法

分子信标是一结构特殊的单链核酸探针，分为环状区和茎干区，两端分别结合荧光发射基团和荧光淬灭基团，如图4-7所示。分子信标的环状区与待检测靶基因序列互补，长度一般为15~30个碱基；茎干区由探针分子两端的数个互补配对的碱基组成，通常为5~8对。当体系中不存在靶基因时，分子信标以茎环结构存在，荧光发射基团和荧光淬灭基团互相靠近，不产生荧光；当存在靶基因时，在退火阶段，分子信标与靶基因杂交，其茎干区被打开，荧光发射基团远离荧光淬灭基团，发岀荧光信号；延伸结束，分子信标又恢复茎环结构，荧光又被淬灭。分子信标法荧光背景信号低，灵敏度高；不足之处是杂交时探针不能完全与模板结合，因此稳定性差，且探针合成时标记较复杂。1

检测模式PCR过程的监测有多种检测模式。最常用的有三种检测模式：

⑴SYBR Green I 检测模式。温度循环为94-55-72°C三步法，只有引物，无探针，荧光染料镶嵌在双股螺旋链中间。通过对特定方向的强荧光检测获得信号，这种试剂检测模式易产生非特异信号，且本底光较大。

⑵水解探针（Taqman Hydrolysis Probes）模式。温度循环为94-60°C二步法，不仅有引物，还有另外一个特异针对扩增模板的探针在引物对之间。在探针相邻两个碱基上分别结合两个荧光染料，一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态。当Taq酶在60°C延伸扩增链时，遇到探针，利用Taq酶5-3外切酶活性将探针水解成单个碱基，单个碱基之间距离较远，第一个染料的能量无法传给第二个染料，只好通过发射特征光子回到稳定态，通过对溶液中第一个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式增加了检测信号的特异性，但是由于利用了Taq酶5-3外切酶活性，一般试剂厂家只给Taq酶的聚合酶活性定标，没有同时给Taq酶5—3外切酶活性定标，不同批号试剂之间会给定量带来差异。另外对探针的熔点温度（Tm）仅要求其高于60°C，这就使不同试剂盒之间的特异性参差不齐，而且无法做质控检测。

⑶双杂交探针（Hybridization Probes）模式。温度循环为94-55-72°C三步法，有引物，二个特异针对扩增模板相邻的探针在引物对之间，在一个探针3碱基上结合一个荧光染料，在另一个探针5碱基上结合第二个荧光染料。在55°C时，两个探针都刚好接合在模板上，第一个染料接受激发光得到的能量传给了第二个染料，接受能量的第二个染料通过发射特征光子回到稳定态，通过对结合在扩增模板上双探针中第二个染料的荧光检测获得信号。这种试剂检测模式中荧光信号与特定杂交温度相关，探针的浓度始终保持不变，因此可以在扩增后检测熔解曲线作为信号的特异性质控。另外这种试剂检测模式可以用于点突变检测。2

特点实时荧光定量PCR由于荧光物质的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，克服了常规PCR的许多缺点，具有如下优势：①能对模板定量；②封闭反应，无需PCR后处理，污染少，假阳性率低；③观察和记录自动化，结果直观，避免人为判断带来的误差；④工作效率高，利于实现高通量检测。

实时荧光定量PR的缺点表现：①需要特殊设备以及荧光探针，成本较高；②不能显示PCR产物的片段长度；③定量准确性还有待提高。

关键点RT-qPCR影响分析可靠性关键点：

1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计

2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性

3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。

由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：

1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品

2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞

3.总RNA或者mRNA

4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略

5.不同的酶以及酶的不同组合

6.变异系数、灵敏度

7.多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。

8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。3

优化方式PCR优化主要有：

1.引物的浓度

2.建议使用SYBR Green I和EvaGreen 进行扩增和溶解曲线的测试

主要操作流程：

1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断，设计引物。DNA引物长度：15-25 个碱基GC含量：50%左右如果引物的与AT区域富集结合，可以考虑用LNA替换几个碱基，较少引物的长度以及避免引物次级结构和3’端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争，分之内杂交，倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低，因此我们选择引物二聚体的△G为负值，即：