[科普中国]-重叠延伸PCR

重叠延伸PCR技术 (genesplicingbyoverlapextension PCR，SOE PCR)，是采用具有互补末端的引物，使 PCR 产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术1。

技术原理重叠延伸 PCR 的原理并不复杂，如果有 2 个基因或者一个基因和一个终止子，要将它们连接到一起，最先想到的是借助于限制酶切和 DNA 连接酶的方法，但有时并不一定能找到合适的酶切位点，或者找到了，但该酶又非常昂贵。且可能只用一次，在这种研究背景下，重叠延伸 PCR 技术就应运而生了2。

比如有 2 个基因，一个命名为M。一个命名为 N，基因 M 和 N 序列如下所示2：

M：5’一ATGCATGCTAGCTAGAACG—CTACGCTGACTACCCCCTGATC一3’

N：序列为5’一ATGCTAGTAGCTAGCCCCC—CCCAGGGGATAATTTTTTAAAACG一3’

现在要将它们连接到一起，首先必须要设计引物，假设引物的序列为2：

M1：5'一ATGCATGCTAGCTAGAACGCT一3’

M2：5’一GGGGGGCTAGCTACTAGCATGATCA—GGGGGTAGTCAGCGT一3’

N1：5’一ACGCTGACTACCCCCTGATCATGCTA—GTAGCTAGCCCCCC一3’

N2：5’一CGTTTAAAAAATTATCCCCT一3’

该过程的目的是将基因 M、N 通过 PCR 的方法连接起来，观察上面的引物 M2 和 N1，会发现它们要比另外2 条引物长很多，这是因为在设计的时候将 M2 的 5’端加入了 20 个 N 基因 5’ 端的序列，在 N1 的 5’ 端加入了 20个 M 基因 3’ 端的序列，然后再进行如下相关步骤2：

①以M1、M2扩增M基因，N1、N2扩增N基因2。

②回收M、N基因2。

③以M、N为共同的模板，M1和N2为引物，扩增M+N，这样就将M+N拼接起来了3。

对引物的分析如下：这里关键的2个引物是M2和N1。可以看出，M2的5’端前20个碱基与N序列5’端的前20个碱基互补，而M2的后20个碱基与M序列的3’端的前20个碱基互补。N1的5'端前20个碱基与M序列的3’端前20个碱基相同，即与M基因的另外一条链互补，N1的后20个碱基与N序列5’端的前20个碱基相同，即与N基因的另外一条链互补。M1和M序列的5'端前21个碱基相同。N2和N序列的3’端前21个碱基互补3。

技术关键引物设计重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键。相连引物间的重叠区域以15-20个碱基为宜，重叠区域中应尽量避免富含 AT(ATTTA，AATAA、AATTAA等) 的序列，因为在片段合成过程中，接头区富含AT的区域极易发生错配1。

Taq酶选择为了最大限度地避免碱基的错配，重叠延伸 PCR 反应应避免使用普通 Taq酶，因为 Taq酶会在 PCR 产物末端加 A，从而可能会使产物移码突变。一般采用高保真 DNA 聚合酶1。

热循环条件对于重叠延伸 PCR 反应，循环不宜过多，变性的温度也不宜过高，时间不宜过长。高温会使 DNA 受到损伤，造成 DNA 酶终止合成。考虑到DNA 聚合酶的扩增效率、错配率，每一轮反应的循环数控制在 20-25 个为宜。循环次数过多，碱基错配的几率增大；循环次数太少，则得不到足够的拷贝数进行下一轮反应。反应的退火温度也要根据引物而定，在保证产物扩增效率的前提下，应尽量提高退火温度以提高产物的特异性，为下一轮PCR反应提供高质量的模板，从而降低反应的错配率1。

技术应用利用重叠延伸PCR技术扩增长片段DNA采用一段已知的500—600 bp碱基的DNA片段为PCR模板，根据所要合成的DNA序列可以设计一系列的PCR嵌合引物对(即碱基互补配对)，长度为50—60 bp，且从5’到3’方向顺序重叠，重叠碱基数目为25—30 bp，通过多重PCR全部引物叠加所得到的DNA正是自己所要合成的长片段DNA1。

用重叠延伸PCR技术构建融合基因 以融合A和B两基因为例，A、B两基因可以相同也可以不同，先分别用al、c1和a2、c2两对引物扩增出A基因和B基因，然后再用al和c2将两基因连接起来，得到A、B的融合基因。也可以设计多对引物，融合多个基因。重叠延伸PCR可将任意的两个目的基因拼接连接，中间无任何目的基因以外的其他DNA序列，这样就可避免因加入连接序列可能出现的表达蛋白质的功能异常1。

利用重叠延伸PCR技术进行基因定点诱变基因突变技术是蛋白质工程中应用的重要技术之一，可以有目的地改变DNA序列中的碱基，从而阐明基因表达的调控机理，研究蛋白质结构与功能间的关系，改造天然蛋白质，使之更符合应用需求。重叠延伸PCR技术可以在DNA片段的任意部位产生定位突变。它在需要诱变的位置合成两个带有变异基因碱基的互补引物(如引物b和引物c)，然后分别与5’引物和3’引物(引物a和引物d)作PCR，这样得到的两个PCR产物分别带有变异碱基，并且彼此重叠，在重叠部位经重组PCR就能得到诱变的PCR产物。任何基因，只要两端及需要变异的部位的序列已知，就可用PCR诱变去改造基因的序列。方法简便易行，结果准确、高效，因此已成为最常用的定位诱变方法1。

技术展望1.同常规PCR相比，重叠延伸PCR技术无疑具有更广阔的应用前景。经过十几年不断的实践与总结，重叠延伸PCR方法的体系已日趋成熟，成为分子生物学研究中的常用方法。重叠延伸PCR已在许多研究领域发挥重要作用1。

2.但是，作为一种没有标准化反应条件的技术体系，重叠延伸PCR技术在应用过程中还存在很多问题需要解决，例如最合适的引物长度、最佳连续延伸的循环数等。这些问题还需要进行系统的研究，才能为该技术的应用提供更有力的理论支持1。

本词条内容贡献者为:

成玉林 - 副教授 - 重庆大学