科技服务助力“秸秆变肉”暨千万头肉牛工程-牛活体采卵体外胚胎生产技术

牛活体采卵（ OPU）-体外胚胎生产（ IVP）技术发展日渐成熟和完善。如今，OPU技术结合IVP技术已经成为优质肉牛快速扩繁的最主要技术手段，良种肉牛的繁殖效率得到极大提高。

一、肉牛活体采卵技术

（一）供体牛的选择

供体牛一般选择为3～6岁，体重超过500kg，性情温顺，有正常的发情周期，健康无繁殖疾病，未孕母牛，卵巢直径大于1.5cm，膘情适中，体况评分标准为3.0～4.0 之间。

（二）采卵方法

供体牛保定后尾椎硬膜麻醉，镇静，清除直肠宿便，使用碘伏消毒外阴部且用70%酒精脱碘，然后直肠把握法确认卵巢的位置和状态。采卵是通过将借助超声波扫描仪定位，确定采集卵泡的位置和大小，利用18G一次性采卵针刺入2～6 mm卵泡，同时用脚开启真空器（泵）开关，将卵泡液抽吸到恒温保存的50 ml离心管中，抽吸完成后显示屏中卵泡的黑色圆斑画面消失，确认完全后冲洗与釆卵针相连的导管确保卵子进入50 ml离心管。采卵过程中容易抽吸到血液，凝集后造成堵塞导管，使卵子丢失，因此采卵液中加入一定量的肝素，防止血液凝集。

（三）影响活体采卵因素

OPU 的生产效率主要受到采卵的技术因素和供体牛的生理因素影响。技术因素主要包括采卵设备和采卵技师的操作熟练程度，生理因素包括供体牛的年龄、身体状态、发情周期、采卵频率、激素、优势卵泡等。技术性的影响因素可以通过购置先进的设备以及雇佣熟练的采卵技师来消除，而牛生理因素的影响则需要通过更多的科学研究来规避。

二、肉牛体外胚胎生产技术(IVP)

（一）肉牛卵母细胞体外成熟（IVM）

采卵结束立即把收集的卵泡液递送到实验室，并进行检卵及体外培养操作。将OPU 采卵液倒入集卵漏斗中，用洗卵液洗涤 3～5 次（少量多次）直至颜色清晰，将集卵漏斗剩余液体倒入90mm平皿，冲洗漏斗2～3次，在体式显微镜下筛选符合条件的卵母细胞。

根据卵丘细胞层的数量和细胞质外观进行形态分类，选择回收良好的卵母细胞。卵母细胞外形颜色较好，胞质分布均匀，细胞外围紧密围绕 1～3 层卵丘细胞的卵母细胞进行体外成熟培养；形态较好的裸卵也进行成熟培养但不计入试验数据；质量较差的卵母细胞计入采卵总数后丢弃不再培养。用常规成熟液在35 mm平皿中做 7个100 μL的培养滴，然后 3 mL 矿物油覆盖隔绝空气。将培养盘提前放入 38.5℃、5% CO2 的饱和湿度培养箱平衡 2～4 h。然后将洗好的卵母细胞转入培养滴中，在 38.5℃、5% CO2 的饱和湿度培养箱培养 22～24 h。

卵母细胞IVM是IVP的第一步，卵母细胞成熟的质量直接决定着后续IVP的成败。任何细胞的生长都离不开充足的营养物质、适宜的温度和合理的气相环境。牛卵母细胞IVM需要非常全面的营养供给，目前最常用的培养基是 TCM199 培养基。此外，培养基中需要添加比例均衡的营养因子比如胎牛血清、卵泡刺激素、黄体生成素、雌二醇和表皮细胞生长因子等，否则卵母细胞的成熟和发育将会受到影响。温度和二氧化碳浓度对卵母细胞的成熟也非常重要，温度和二氧化碳含量过高或者过低都会抑制卵母细胞成熟，通常牛卵母细胞成熟的环境中，温度应该控制在38～39 ℃，二氧化碳含量控制在5%。

（二）体外受精技术（IVF）

取一根冷冻精液在38℃的水浴锅中解冻，在15 mL离心管中加7 mL洗精液和解冻后精液，1500 r/min离心2次，每次 8min。第一次离心完吸出上清液（切勿吸到沉淀），然后再加入洗精液至7 mL，两次离心后轻轻吸出全部上清液，加入适量的受精液，调整精子浓度为100 万/mL，放入CO2培养箱获能 2～4 h。卵母细胞受精前用透明质酸酶消化处理，并吹打卵母细胞脱去卵丘细胞，最后将卵母细胞放入获能的受精滴中在CO2培养箱中培养8～16 h。

IVF是紧随IVM的另一个关键步骤，完全成熟的卵母细胞才能有较高的受精率，因此上述影响卵母细胞成熟的因素都会对受精效率产生影响。精子的质量和浓度也是决定受精质量的关键因素。在开展商业化的OPU/IVP技术时，通常先将公牛精液在卵母细胞上进行受精测试，以确定精液的最佳受精浓度。此外，精液的处理方式、 受精环境以及外源因子也会对受精效率产生影响。

（三）胚胎体外培养技术（IVC）

体外受精结束后，反复吹打受精卵脱去周围精子和杂质，将受精卵移入提前平衡2～4 h的成熟液的前期培养液中置于CO2 培养箱培养2天后，将受精卵移入成熟液的后期培养液中置于CO2 培养箱培养，之后每2天进行半量换液直至第7天形成囊胚。

IVC是整个IVP过程中的最后一步，也是整个IVP阶段最复杂的一步。影响体外胚胎发育的因素有很多，目前关于影响胚胎IVC的因素也还有很多未解之谜。受精卵自身的质量是影响体外胚胎发育的直接因素，研究发现有卵丘细胞的卵母细胞受精后的囊胚率要远比裸卵受精后的囊胚率高，而且卵丘细胞越完整囊胚率越高。另外，培养体系也是影响体外胚胎发育质量的关键因素之一。IVC体系在过去几年中已经有了显著的改进，市场上已有多种商业化的培养基。除此之外，其他环境因素如培养的环境温度、气相（氧气和二氧化碳浓度）都会对体外胚胎的发育有影响。研究发现，在38.5～39.0 ℃，氮气含量控制在90%，二氧化碳和氧气浓度5%的培养环境下更有利于牛胚胎的发育。

三、牛活体采卵-体外胚胎生产技术应用

吉林省奥金斯农牧科技发展有限公司于2016年开始活体采卵（OPV）-体外受精（OVF）技术、胚胎工厂化、程序化冷冻胚胎等生产技术攻关以来，经过多年的试验，攻克了胚胎冷冻、移植受胎率、初生重等多项生物技术难题，能够批量生产胚胎和规模化移植，在吉林、内蒙古、河北、河南等地进行了应用，冻胚规模移植受胎率平均达到43%，鲜胚受胎率平均达到54%。