科技服务助力“秸秆变肉”暨千万头肉牛工程-肉牛性别控制技术-

肉牛性别控制技术是指对通过人为干预的方式，使其繁殖产出人们所希望性别后代的一种繁殖技术。应用该技术繁殖母牛可加速牛群扩繁，繁殖公牛可提高生产育肥牛生产能力，用于育种能加快遗传改良进度。目前常用的是精子分离法，将种公牛精子分离后制备雌、雄两种冷冻精液，选择需要的性控冻精进行人工授精，从而实现犊牛的性别控制。

一、原理

将种公牛精液中的精子通过流动细胞检索分离法，使X染色体和Y染色体进行有效分离，分装冷冻后进行人工授精。用含X染色体的精子配种，母牛怀孕后可产母牛犊，相反含有Y染色体的精子配种，母牛怀孕后可产公牛犊。

二、原精的准备与处理

（一）原精

采集的精液活力不低于80%的优良种公牛作为原精来源，原精测定其密度和活力后，添加适量抗生素，置入18～20℃保温容器内，送到实验室，并在18～20℃条件下保存。每份原精从采集后开始，可供8～12小时分离处理使用。

（二）染色处理

取原精在 34℃条件下水浴 Hoechst33342染色45分钟。在染色过程中每隔10～15分钟轻轻摇匀精液（或上下颠倒 2或3 次），保证精子充分染色。50µm滤器过滤、分装在两个4 mL的上机管中，开始上机分离（上机的精子浓度为1亿个/mL）。每份染色后的精子样品使用时间不超过1小时。

（三）精子分离操作

1.开机和调整。首先打开真空泵、空气压缩机、自来水开关、热交换机，然后打开主机的电子柜、计算机软件、激光，分离机进入工作状态。清理 tip 头，调整水柱后（3条清晰水流，调整中间水流进入废液管）用精子细胞核测试分离图形，根据分离准确率要求测试样滴延迟。

2.上样和分离。按照要求把机器的分离技术参数调至需要状态，然后把染色后的精子样品装入分离样品台，开始分离工作状态。根据不同要求，可以收集单性的 X 或 Y 精子，也可同时收集两种精子。控制分离时间不超过 2小时。记录分离时间、状态等信息。

3.清洗和关机。原则上精子分离机每运行 24小时要求进行管道的清洗灭菌，以保证产品质量。清洗内容包括 sheath 管道，清洗液使用顺序是清水-热水-乙醇-超纯水。另外，对于整个分离机管道，定期用专用清洗液灭菌清洗，并根据使用状态每年更换一次。除分离机管道之外，每周在停机时需要清理喷嘴内部，分离舱室、电极板、废液缸及清理操作台。分离结束后关闭激光器、电脑，待内循环水冷却后，关闭热交换机和自来水（气冷式激光管无此操作）。之后按顺序关闭分离机样品站、压力开关，外接真空泵、空气压缩机和空调。

（三）精子分离平衡和冷冻保存

1.分离精子平衡。按照计数比例稀释精液，将稀释后的精液在显微镜下计数，并计算 6次的浓度平均值。性控精子数量标准是 200万～220万个/0.25 mL，终浓度要求为1000万个/mL。

根据中间精子浓度计算出精液的最终稀释体积。中间精子浓度=平均精子数×稀释倍数×10000；最终稀释体积=中间精子浓度×中间总体积/1000。

2.冷冻保存。每分离4-6小时集中冷冻保存一次。以180 L 液氮罐为冷冻保存处理容器，该液氮罐具有内部温度测定装置，可以准确地显示冷冻处理时样品的温度及其变化情况。

3.精液灌装.装管前，显微镜下目测精子的活力不低于 60%。使用细管灌封机分装精液时，细管灌封机必须放置在 0～5℃的低温操作室中。

4.冷冻处理。将液氮罐内的气层调整到-90℃，平稳地把冷冻齿板移入冻精支架上（液氮面与冻精管的距离为7cm），盖上液氮罐盖，开始冷冻降温计时。当液氮罐内的气层温度降至-120℃时（保持20分钟以上），回收冻精细管将其直接投入液氮当中。

三、授精

性控冻精人工授精与常规冻精人工授精方法基本一致。但要注意以下几点：

1.参配牛必须健康。要求无生殖系统疾病及其他疾病，营养均衡，体况适中，以青年牛(1、2产）为主。

2.输精时间准确。做好母牛发情鉴定，通常发情后10～12小时可进行配种，可比常规冻精输精时间晚3～4小时。最好通过直肠检查法判断卵泡的发育程度，卵泡膜变薄、表面光滑，卵泡波动明显时可进行配种。可进行两次输精，在第1次输精后，间隔6～10小时进行第2次输精。

3.解冻。冻精从液氮罐取出后，在空气中停留3～5秒钟，然后放入38～40℃温水中12～15秒钟。

4.按程序操作。清理宿粪，清洁外阴，操作者将清洁消毒后的手缓慢伸入直肠找到子宫颈，另一只手持输精管插入阴道，呈前高后低姿势，防止错插入尿道，之后转入水平前进，插到宫颈口，然后慢慢通过子宫颈，进入子宫体。

5.输精位置确切。一般输精位置在成熟卵泡发育侧子宫角基部前2～3厘米至大弯处或子宫体输精。

四、注意事项

1.要做好性控冻精的保存。性控冻精通常使用液氮进行保存，要使用液氮罐进行保存，保存过程中要及时补充液氮，不要撞击和倾斜液氮罐。如果将冻精转移到其他容器中，动作一定要快。

2.要做好输精准备工作。做好发情母牛的保定和外阴、输精器具的清洗、消毒。

3.要做好人员准备。输精人员要穿戴好防护装备，修剪指甲，手臂消毒，带长臂手套，手臂涂抹润滑剂等。

4.输精后发现炎症及时治疗。如果配种后发现有炎性分泌物，可以在输精后1～6小时宫注抗生素，以提高受胎率。

5.结合促排卵保胎激素药物。对于排卵延迟的的牛可结合使用肌肉注射促排3号、绒毛膜促性腺激素或促黄体生成素等。促进卵泡成熟排卵，缩短输精后精卵结合时间。

6.药物辅助。配种时结合应用维生素A、D、E，亚硒酸钠V、E等药物可提高受胎率。