中国科大揭示CRL2 APPBP2 E3泛素连接酶调控蛋白质降解的分子机制

我校生命科学与医学部许超教授、张凯铭教授与以色列巴伊兰大学Itay Koren教授合作，揭示了CRL2APPBP2E3泛素连接酶识别底物羧基端降解信号（C-degron）的分子机制，相关成果以“Molecular basis for C-degron recognition by CRL2APPBP2ubiquitin ligase”为题于10月16日在线发表在《PNAS》杂志上。

泛素-蛋白酶体系统（UPS）是真核细胞中的主要蛋白质降解通路，介导泛素化依赖的蛋白质降解，通过消除不需要或折叠错误的蛋白质，在蛋白质质量控制中发挥关键作用。在典型的E1-E2-E3泛素化级联反应通路中，泛素连接酶E3通过结合E2~泛素（E2~Ub）和底物，催化泛素从E2转移到底物特定的赖氨酸上。因此，E3决定了UPS的特异性。在大多数情况下，它可以直接识别底物蛋白质中的特定基序，这种基序被称为降解子（degron）。蛋白质暴露的羧基末端降解信号（C-degron），可以被Cullin-RING E3泛素连接酶（CRLs）复合体中不同的底物受体所识别，包括KLHDC2, FEM1A/1C, FEM1B以及APPBP2等。之前的工作中，许超教授课题组通过解析FEM1B、FEM1C与Arg/C-degron小肽的复合物晶体结构，揭示了CRL2FEM1通过识别Arg/C-degron调控蛋白质稳态的分子机制。而APPBP2作为CRL2的另一种底物受体，已被证明能识别底物羧基末端Arg-x-x-Gly基序（R-x-x-G/C-degron）并介导底物的降解，然而，其中的分子机制仍然是未知的。

研究人员体外纯化组装了CRL2APPBP2与三种不同R-x-x-G/C-degron小肽结合的复合物（图1），包括XP_211896（L-T-R-N-K-G-P）、XP_211896的变体（L-T-R-N-K-G-P-A-A）和MRPL28（Q-K-R-A-S-G-Q），通过冷冻电镜分别解析其原子分辨率结构。

图1：CRL2APPBP2二聚体与R-x-x-G-P/C-degron复合物的冷冻电镜结构

结构分析表明，所有C-degron小肽结合在由APPBP2的TPR repeats 6-11所组成的一个深的口袋中，C-degron序列中的Gly和Arg分别被APPBP2口袋中的窄沟槽以及带负电的表面所识别（图2）。另外，APPBP2残基与XP_211896 C-degron的Arg-5、Asn-4和Lys-3的主链氢键网络赋予了-5RNKG-2基序刚性，从而阐明了C-degronArg和Gly之间需要间隔两个残基（R-x-x-G）的机理。此外，生物化学实验进一步表明R-x-x-G在C-degron序列中的位置具有一定可塑性，R-x-x-G羧基端加入1-3个残基不影响与APPBP2结合。

图2：APPBP2识别R-x-x-G/C-degron的分子机制

研究人员利用突变、等温滴定量热（ITC）实验验证APPBP2与R-x-x-G/C-degron作用界面，并进一步通过细胞内基于双荧光的蛋白质稳定性报告系统（GPS）揭示R-x-x-G/C-degron通过招募CRL2APPBP2介导绿色荧光蛋白质降解。以上研究不仅解析了CRL2APPBP2识别R-x-x-G/C-degron的分子机制，而且为未来设计靶向CRL2APPBP2的小分子抑制剂和PROTAC分子提供了基础。