葡萄霜霉菌的抗药性检测与科学用药

一、葡萄霜霉病的为害症状

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葡萄霜霉病是由葡萄霜霉菌［Plasmopara Viticola (Berk et Curtis) Ber.et de Toni］引起的一种世界性病害。目前，世界上几乎所有葡萄产区都有葡萄霜霉病发生。葡萄霜霉病主要危害叶片，也能侵染新梢、卷须、叶柄及幼果等绿色幼嫩组织。叶片感病初期在正面形成淡黄色水渍状边缘不清晰的小斑点，以后逐渐扩大为褐色不规则形或多角形病斑，数斑相连变成不规则形大斑。天气潮湿时，在病斑背面产生白色霜霉状物，即病菌的孢囊梗和孢子囊。发病严重时病叶早枯早落。嫩梢被侵染后，初期出现颜色深浅不一的淡黄色水渍状斑点，后变为褐色略凹陷的病斑，潮湿时病斑也产生白色霜霉。病重时新梢扭曲，生长停止，甚至枯死。卷须、穗轴、叶柄有时也能被害，其症状与嫩梢相似。幼果被害，病部褪色，变硬下陷，上生白色霜霉，很易萎缩脱落，随着果粒变大，病菌侵染机率降低，且侵染后病原菌发育缓慢，可导致果粒表面形成凹形，逐渐变紫，僵硬，皱缩，极易脱落（图1）。

图1葡萄霜霉菌的为害症状

二、葡萄霜霉菌的抗药性情况

病原菌的抗药性是指目标生物个体或群体，在连续接触某种药剂一定时间后，对该药剂发生可遗传的敏感性降低，使药效降低或失去防效的现象。葡萄霜霉病是气传性的流行性病害，化学防治是病害防控中最为重要的手段之一。葡萄生产上常用的内吸性杀菌剂主要有甲氧基丙烯酸酯类（嘧菌酯）、羧酸酰胺类（烯酰吗啉）、苯基酰胺类（甲霜灵）、氰基乙酰胺类（霜脲氰）和磺胺咪唑类（氰霜唑）。由于化学药剂科学使用技术的不完善、使用者相关知识的缺乏以及田间用药不合理等导致防治葡萄霜霉菌多种化学药剂产生抗药性，防效正在急剧下降，严重威胁着葡萄产业的健康发展。

三、葡萄霜霉菌抗药性检测技术

中国农业科学院植物保护研究葡萄有害生物研究组利用叶盘漂浮法检测了不同产区葡萄霜霉菌对不同药剂的抗性，同时还研发了Taqman-MGB检测技术，该技术不受实验材料、培养环境等外界条件限制，具有方法稳定、检测效率高、灵敏度较高、特异性强、假阳性低等优点。

1、传统检测方法—叶盘漂浮法（图2）

（1）样品的采集及处理： 将在田间采集的新鲜葡萄霜霉菌病样，室内重新培养出新鲜的菌层；

（2）制作叶盘：选择健康的‘里扎马特’新鲜嫩叶并进行叶片表面消毒，在超净工作台中用直径15 mm的打孔器将其打成叶盘，将叶盘轻放到相应浓度的药液中，叶背面朝上，每皿10个叶盘，对照组采用无菌水代替药液；

（3）接种霜霉菌：将纯培养后新鲜的霜霉菌配制成浓度为1 × 106个/ml的孢子悬浮液，滴在叶盘中央，每个叶盘滴10 μl；

（4）培养及结果调查：将其置于培养箱中黑暗处理24 h，然后用灭过菌的滤纸条将叶盘背面的液滴吸去，后置于培养箱中培养，7 d后调查结果。根据发病情况判断抗药性情况。

图2叶盘法测定抗药性示意图

2、分子生物技术检测- Taqman-MGB抗药性检测技术

根据葡萄霜霉菌对烯酰吗啉和嘧菌酯产生抗药性后发生基因突变的原理建立了Taqman-MGB检测技术。

（1）样品的采集及处理： 将在田间采集的新鲜葡萄霜霉菌病样，在室内保湿培养新的霉层；

（2）霜霉菌DNA的提取：利用E-Z○R96 Fungal DNA Kit提取试剂盒进行提取；

（3）利用已开发的Taqman-MGB探针，通过荧光定量PCR检测不同葡萄产区霜霉菌的抗药性。

四、检测结果

1.采用叶盘法检测了部分产区霜霉菌对甲霜灵、氰霜唑及霜脲氰的抗性情况，此方法对试验设备要求低、操作简单、节省材料、与田间发病反应最为近似(图3）。

图3 叶盘法检测结果

2. 采用Taqman-MGB分子检测技术进行了部分葡萄产区葡萄霜霉菌对嘧菌酯和烯酰吗啉抗性鉴定，发现不同地区抗性差异明显，辽宁北镇霜霉菌群体对QoI抗性达到100%，而山西群体QoI抗性频率为4%（图4）。对于CAA类杀菌剂，辽宁北镇霜霉菌群体抗性等位基因频率达到96%，其中杂合子敏感型站到45%，抗性菌株为51%（图5），说明抗性群体正在这一区域迅速蔓延，此方法能够准确区分野生型，抗药突变型与杂合型，灵敏度达到1pg，并且除了单菌株鉴定之外，还可以进行混合样品定量检测，能够大大减轻工作量，提高效率，适合于具有荧光定量PCR的实验室应用。

图4 Taqman-MGB探针检测QoI抗性

图5 Taqman-MGB探针检测CAAs抗性

根据检测结果，辽宁北镇产区不能继续用嘧菌酯和烯酰吗啉防治霜霉病，建议更换其他防治霜霉病的药剂，并注意连续使用次数，一般同一种药剂连续使用不能超过3次；山西产区可以继续使用这两种药剂防控葡萄霜霉病，但注意药剂间的轮换使用。抗药性的检测不仅为霜霉病的防治打下基础，还为农药精准选择、合理轮换使用杀菌剂，降低农药使用量提供科学指导意见。

作者：孔繁芳 王忠跃 刘永强 张昊（中国农科院植保所）

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