生殖干细胞：构建基因编辑家畜的“利器”

南京农业大学干细胞研究与转化中心主任 邹康

工程化育种技术是利用现代生物学技术建立的新型育种技术,即通过干细胞体外培养、基因编辑、体外诱导分化、克隆等技术来实现优良性状相关基因的筛查和品种选育。这不仅能显著加快育种速度、缩短培育周期,提升优良品种的选育效率,而且能够有效提高动物产量和育种质量。因此,不论是在应对自然环境变化或国际局势突变等情况造成的地方优良品种或濒危种畜的危机等重大战略方向上,还是在减少激素和抗生素的使用,改善家畜肉质健康等关乎民计民生的问题上,都具有重要的战略意义。

基因编辑技术与克隆技术结合,可以用于构建含有编辑过的基因的动物(简称基因编辑动物),为工程化育种提供基础。目前常用的构建基因编辑动物的技术有以下4种技术,分别是:

1. 体细胞核移植技术。这项技术最著名的成果就是多莉羊的克隆,即用供体的体细胞细胞核与卵母细胞的胞质融合并在体外发育,然后通过胚胎移植技术植入代孕受体子宫,发育得到的子代个体。由于体细胞基因组的表观修饰等原因导致多莉羊的寿命很短,这也限制了这项技术的进一步应用。

2. 原核注射法。该方法通过将构建好的载体DNA注射到受精卵的原核(一般是雄性原核)中,或将sgRNA,模板DNA和Cas9蛋白的组合注射到受精卵中,实现基因编辑,再将注射完成后的胚胎在体外培养到适合的阶段,然后移植到假孕受体的子宫中,发育成带有新性状的子代。

3. 基因打靶技术,即将经过基因编辑的胚胎干细胞(ESCs)或诱导性多能性干细胞( iPSCs)这类多能性干细胞植入发育的囊胚中,再通过胚胎移植技术植入受体的子宫,发育得到一个源自于多能性干细胞的后代。虽然这个技术在小鼠这类模式动物上很成熟,但在家畜克隆上仍存在一些技术难题。最大的障碍就是目前建立的家畜多能性干细胞系的功能还不够完善,特别是生殖嵌合能力偏弱,把编辑的遗传性状传递给后代的效率较低。而用iPSCs诱导技术,可能会由于过表达原癌基因造成一定的风险性,以及表观修饰的问题也会对后代的健康造成潜在的影响。

4. 生殖干细胞移植技术,即从优良性状的个体分离生殖干细胞(包括精原干细胞或卵原干细胞),在体外培养,通过基因编辑技术对生殖干细胞的基因组进行修饰以获得新的性状,然后有三个途径获得基因编辑后代:一是将这些干细胞移植到受体的性腺中,那么这些干细胞就可以在受体的睾丸或者卵巢中源源不断的产生含有这些优良性状基因的配子,进而通过自然交配或者人工授精的技术,得到大量子代;二是通过生殖干细胞的一个特性,即在体外培养的过程中会自发转化成类似于胚胎干细胞的多能性状态,从而可以代替家畜的胚胎干细胞或iPSCs进行基因打靶;三是利用类器官技术将生殖干细胞体外诱导成为有功能的配子,再通过人工授精获得子代。

相比于前三种技术,利用生殖干细胞构建基因编辑动物的方法属于较新的思路。虽然精原和卵原干细胞的分离培养和移植技术已经分别在上世纪九十年代和2009年建立,但这些技术仅在啮齿类动物上取得了成功。由于科学技术发展的限制,大动物生殖干细胞的研究一直相对滞后。直到近几年,猪、羊等家畜的生殖干细胞分离培养技术陆续被攻克,这意味着利用生殖干细胞构建基因编辑的家畜的时代即将到来。

生殖干细胞在工程化育种上有独特的优势,即最直接的生殖力传递:生殖干细胞的功能是分化成配子(精子或卵子),因此将基因编辑过的生殖干细胞植入受体后,可以源源不断的产生含有优良性状基因的配子,并高效的得到后代。相比之下,大动物的多能性干细胞,比如胚胎干细胞或者iPSCs,其生殖力嵌合的能力低于小鼠的多能性干细胞,导致获得基因编辑子代的效率要低于生殖干细胞。

值得注意的是,近几年随着类器官技术的迅猛发展,利用生殖干细胞建立睾丸或者卵巢类器官这一新思路为家畜工程化育种带来了新的方向。类器官是让干细胞在培养皿中形成一个类似于器官且有生物功能的组织结构,比如利用小鼠和人类的干细胞已经能够较好的建立大脑、肝脏、肾脏、皮肤、睾丸、卵巢等组织的类器官,并具备了部分的生物学功能。因此,如果能够建立有功能的家畜睾丸类器官或卵巢类器官,则可以直接在培养皿里形成精子或卵子,进一步提升了生产效率,节省了时间空间,也可以将优良品种的干细胞作为重要的品种资源进行战略储备。

然而到目前为止,虽然生殖干细胞技术在小鼠等模式动物上取得了巨大的成功,但家畜生殖干细胞技术仍处于发展的起步阶段,家畜生殖干细胞的体外稳定培养、定向分化、类器官建立等技术都遇到了技术瓶颈,属于国际竞争的热点。国内外科研团队目前针对家畜生殖干细胞的重编程、类器官构建和体外诱导分化等核心技术,都投入了大量的人力物力,希望早日有所突破。

实际上,导致这些技术发展受限的瓶颈是调控大动物生殖干细胞的自我更新和分化机制的研究仍不清晰,这也限制着家畜生殖干细胞在畜牧学上的应用。因此,聚焦大动物生殖干细胞的生物学特征,探究生殖系统内调控其增殖分化的信号通路,将会极大的推进生殖干细胞在动物工程化育种方向的应用,进一步提升我国畜牧业的竞争力。与此同时,应进一步完善基因工程技术在畜牧学领域应用的法规政策,建立规范安全的应用准则,从而更高效安全的推进我国的畜牧业发展。

作者简介

邹康,南京农业大学干细胞研究与转化中心主任,南京农业大学动物科技学院教授、博士生导师。研究方向为生殖干细胞与微环境的相互作用机制及生殖干细胞的转化应用。在Nature Cell Biology等期刊发表论文三十余篇,被引用超过1200次,工作被Nature,Science等杂志专版评论,获得了国家自然科学二等奖(第二获奖人),江苏特聘教授等奖励和荣誉,担任Zoological Research期刊编委。