作者：谷猛（中国科学院青岛生物能源与过程研究所 微生物制造工程中心）
策划：李辉 吕雪峰
文章来源于科学大院公众号（ID：kexuedayuan）
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紫杉醇的大名很多人都听过，这种从红豆杉树中提取的天然药物是抗癌的明星产品。它给许多患者带来希望的同时，也给红豆杉树造成了毁灭性的打击。
那有没有办法人工生产紫杉醇呢？这就要靠那些“小不点”啦！
正在化疗的癌症患者（图片来源：veer）
风光无限的紫杉醇
紫杉醇药物自从1992年被美国食品药品管理局（FDA）批准上市以来，销售额屡创新高，1994年销售额就达到4亿美元，2000年销售额更是达到16亿美元，创下单一抗癌药销量之最。目前，紫杉醇已成为世界销量第一的抗肿瘤药物，也是世界上公认的强活性广谱抗肿瘤药物，被誉为20世纪90年代抗肿瘤药的三大成就之一（其他成就：喜树碱、维A酸）。
紫杉醇具有什么独特的抗癌机制，能获得如此多的赞誉和肯定呢？这就不得不提到一位女科学家Susan Band Horwitz博士。Horwitz博士通过长期研究，最终于1979年阐明了紫杉醇独特的抗癌作用机制。2019年，Horwitz博士也凭借这项研究成果荣获素有“小诺贝尔奖”之称的加拿大盖尔德纳国际奖。
Susan Band Horwitz博士（图片来源：https://www.pnas.org）
紫杉醇抗癌，首先要从微管蛋白说起。
微管蛋白是细胞体内重要的物质，存在两种形态——细胞正常时微管蛋白和细胞分裂时形成的微管蛋白二聚体。微管蛋白不断发生着组装和降解，才能让细胞正常进行分裂活动。
紫杉醇的作用便是促进微管蛋白聚合形成二聚体，同时防止二聚体构成的微管解聚。也就是说，紫杉醇会让细胞在分裂过程中被“卡住”，细胞就会停止分裂，进而发生凋亡。本来可以无限分裂增殖的癌细胞被按下了暂停键，紫杉醇的抗癌作用也就得到发挥了。但是紫杉醇不光对癌症细胞起作用，也能对正常分裂的细胞起作用。为了降低其副作用，目前通常采用紫杉醇包埋靶向药物载体的方式对癌症部位进行靶向治疗，有效减少对机体其他正常分裂细胞的副作用。
对照（左）细胞正常分裂；紫杉醇（右）抑制细胞微管的解聚，阻止细胞分裂（图片来源：参考文献17）
此外，随着对紫杉醇的不断深入研究，科学家还发现紫杉醇不仅可以用于治疗卵巢癌、乳腺癌、肺癌等癌症疾病，还可以用于制备心脏支架的药物涂层，来抑制血管继续变窄等作用，同时也是研究微管的结构、动力学和功能的重要工具。
虽然紫杉醇具有如此多的优点，但却存在着一个致命的缺陷——原材料供应。
两难之境：紫杉醇原材料问题
紫杉醇唯一的原料来源便是数量极其稀有的红豆杉。红豆杉，又称紫衫或赤柏松，最早起源于中侏罗纪，是远古第四纪冰川遗留下来的古老孑遗植物，是世界上公认濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物，数量极其稀少且生长缓慢仅在北半球存在零星分布，是我国国家一级保护植物，被称为“植物界的大熊猫”。
红豆杉照片（图片来源：Wikipedia）
红豆杉的树皮中紫杉醇含量最高，但最高含量也才仅为0.01％—0.02％。正因如此，粗品紫杉醇的价格曾一度炒到200万美元/公斤，面对高额收购价，利益熏心的人终于坐不住了，纷纷开始对植物界的“大熊猫”红豆杉下手。
“匹夫无罪，怀璧其罪”，因为含有紫杉醇，在二十世纪末的几年时间里，全球超过80%的红豆杉被砍伐一空，中国云南滇西横断山区中的300多万棵红豆杉也不能幸免遇难，大部分被剥掉树皮，默默死去。直到各国国家出台法律严禁砍伐，这场“屠戮”风波才慢慢停息。
从自然资源中提取药物，造福患者，本是件治病救人的好事，但如何在药物开发和保护自然资源之间寻求平衡，这是我们今天必须面对的现实问题。
小不点的大作用
面对紫杉醇原料供应的两难之境，各个领域的科学家开始进行不同的尝试。
首先是化学全合成和半合成策略。
化学全合成是指利用化学结构简单的化工产品为起始原料经过一系列化学合成反应和物理处理过程制得最终产物。早在上个世纪七十年代初，紫杉醇便凭借复杂和新颖的化学结构吸引了全球30多个顶尖化学实验团队参与到其化学全合成中，在之后三十年间，陆续有七个研究小组完成途径各异的合成途径，但合成步骤过长（最少也需要37步），不仅需要使用昂贵的化学试剂，而且反应条件极难控制，收率也偏低（最高也才3%左右）。因此，利用化学全合成生产紫杉醇的想法只能作罢。
10-DAB(左)与紫杉醇（右）化学结构对比（图片来源：参考文献2）
但与化学全合成相伴而生的半合成策略却带来意外的惊喜，半合成则指用具有一定基本结构的天然产物后经化学结构改造和物理处理过程制得最终产物。1981年法国Pierre Potier教授首次从英国紫杉的叶子分离得到跟紫杉醇具有相同母核结构的化合物10-deacetyl baccatin III（10-DAB），并随后利用其为原料成功合成紫杉醇。该方法比天然提取成本低，且对环境生态更加友好。因此利用人工培育速生红豆杉的枝叶作为原料加上化学合成的生产紫杉醇途径开始全面应用，大大缓解了紫杉醇的药源供应问题。紫杉醇的价格也出现严重的“高台跳水”，身价也由200万美元/公斤变成现在2-4万美元/公斤。
Pierre Potier教授为紫杉醇的半合成途径做出卓越贡献（图片来源：https://www.nature.com/articles/440291a）
但是，只要利用植物来源作为前体，就不得不考虑植物生长的周期性、外界天气及其季节等因素导致成本问题，这些都是制约紫杉醇的价格继续下降的重要原因。不过随着生物技术的不断进步，不起眼的“小不点”——微生物却能起到重要的作用。
微生物作为药物来源的优点：
1. 微生物生长繁殖速度快：微生物生长迅速，长的最快的微生物十几分钟之内便可进行一次分裂，易于缩短生产周期，而且还易于培养。
2. 微生物遗传操作简单：工程师对一些明星微生物“知根知底”，用来改造他们的工具也比较完善，这些工具能够助力工程师对微生物进行改造，用于生产紫杉醇。
3. 易于大规模工业生产：在工业上可用发酵罐进行大规模培养并生产紫杉醇，不受天气等因素的影响，同时目前微生物规模化发酵生产的技术较为成熟。
微生物作为紫杉醇的药源既然有这么多优点，那现在发展又如何呢？
如何用微生物生产紫杉醇呢?
利用微生物作为药源生产药物的关键，在于如何从数量众多的微生物中选择合适的那种或那几种微生物进行生产，目前存在两个思路：一是利用本身能产该化合物的微生物进行生产，二来则是利用合成生物学的思路将能产该化合物的途径给“挖过来”安装在如大肠菌株等工程菌株进行生产。因此，我们就这两个途径分别跟大家来聊聊。
1.内生菌发酵
内生菌是一种寄生在健康植物体内的微生物，不会造成任何病状，同时还能给寄主提供反抗昆虫、草食性动物、病原体等作用。1993年美国两位科学家Stierle教授和Strobel教授在红豆杉的树皮中发现一种内生真菌——安德氏紫杉霉(Taxomyces andreanae)，它能够自主产生紫杉醇，这一研究发现让正在解决紫杉醇原料来源问题的科学家大为兴奋，他们开始了对内生真菌的菌种分离和选育工作。到目前为止，已经记录的超过40个真菌属的近200个内生菌能够生成紫杉醇，其寄主范围也不仅限于红豆杉属植物，还包含秃柏、Wollemi松及Torreya grandifolia等非红豆杉属植物。
不同种植材料生长的内生真菌菌落。A树皮碎片，B种子，C树枝（图片来源：参考文献13）
虽然内生真菌介导的发酵过程是一种很有前途的生产紫杉醇的替代方法，但产量不稳定、产量低是开发内生菌生产紫杉醇的巨大挑战。目前报道的产率是从0.001 ng/mL到800 ng/mL不等，远远达不到用于生产的标准，同时还有大部分内生菌实验结果无法重复或者在传代过程中失去生产紫杉醇的特性。这些现象也让不少研究学者质疑，这些内生菌独立于宿主植物外是否还存在合成紫杉醇的能力。虽然也有研究人员从共生、外界环境刺激角度展开研究，来解释内生菌在传代过程中出现的产量下降的问题。但因缺少对内生菌体内具体合成途径的信息，也很难深入研究，这一缺点也是制约内生真菌发酵的问题所在。
2.合成生物学
既然直接利用内生菌进行生产难度比较大，那如果改变策略，将植物体内产紫杉醇途径的相关基因移植到适合生产的工程菌株上是否可行呢？
2001年，Huang QL等人将紫杉醇前体的紫杉醇二烯（taxadiene）合成途径的相关基因导入到大肠杆菌系统中，相关基因成功在大肠杆菌体内表达，其产量为1.3 mg/L的紫杉醇二烯。之后，酵母系统也成功表达并能够生产紫杉醇二烯，到目前为止，最高的异源紫杉二烯产量为大肠杆菌的1.02g/L和酿酒酵母72.8 mg/L。这些结果都表明将紫杉醇合成途径导入到大肠杆菌、酵母等工程菌株中是具有一定可行性的策略，且有很大发展潜力，这种相关基因异源表达的方法也是目前主流研究紫杉醇生物合成的方法。
大肠杆菌多元模块化代谢途径（图片来源：参考文献16）
到目前为止，虽然异源表达系统构建已经取得了惊人的成绩，但距离真正微生物生产紫杉醇甚至10-DAB都还有一定的距离，存在一些问题如植物体内紫杉醇是如何生物合成，每一步是由哪些基因表达的蛋白起的作用，如此复杂且漫长的紫杉醇生物合成途径又要如何导入到异源系统中等等有待解决。相信随着合成生物学，基因编辑，人工底盘细胞的开发等技术的不断进步，在不久将来定能够实现利用微生物产紫杉醇的宏愿。
展望
紫杉醇从发现、生产和应用经历了几十年的研究，在无数科学家的努力下，曾经只能通过提取珍贵红豆杉树皮才能获取的紫杉醇，到现在只需收获枝叶便可以化学合成，未来我们也许利用异源表达的策略和微生物发酵技术，就能源源不断地生产紫杉醇，紫杉醇药物价格也不再会成为患者的经济负担。
前有青蒿酸生物合成的工业化应用作为先驱，后有不断探索的紫杉醇微生物合成，“小不点”微生物已经开始在植物源天然产物的生物合成领域崭露头角了。相信在不久的将来，利用微生物获取更多对人类有益的植物源天然产物将会越来越多的成为可供选择的方案。
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