美妙的生物荧光分子与好奇的生物化学家

光明网 2016-09-01

  美妙的生物荧光分子与好奇的生物化学家 

  做出应获诺贝尔奖工作的科学家,几十年默默无闻;

  被广泛应用的分子,很少人知其发现者;

  原始论文鲜为人知,后继论文倒很热门;

  曾失明的人,发现了美丽的发光蛋白;

  低调的父亲,出了高调的儿子。

  这里简介一项生物化学研究,讲一个科学家的故事,还讨论一个问题:是否活着的科学家中还有因好奇而做科学研究?

  本文和我2002年一篇文章相同,不是预测诺贝尔奖,而是介绍值得获奖的工作。我不介绍可能获奖、但其工作不值得获奖者。相反,本文的主人公可能被埋没得不到奖,但他的工作很值得介绍。

  生物发光和荧光蛋白

  现在研究生物的人,几乎都知道绿色荧光蛋白(GFP),但常常不知或搞错其发现者。毫无争议的发现者是日裔美国科学家下村修(Osamu Shimomura,下村脩)和已故美国科学家约翰森(Frank H. Johnson)。他们1961到1974年发现两种发光的蛋白质:水母素(aequorin)和GFP。

  生物发光现象,下村修和约翰森之前就有人研究。萤火虫发荧光,是由荧光酶(luciferase)作为酶催化底物分子荧光素(luciferin),有化学反应如氧化,以后产生荧光。而发现蛋白质本身发光,无需底物,起源于下村修和约翰森的研究。

  下村修和约翰森用过几种实验动物,和本故事相关的是学名为Aequorea victoria的水母。1962年,下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道,他们分离纯化了水母中发光蛋白水母素。据说下村修用水母提取发光蛋白时,有天下班要回家了,他把产物倒进水池里,临出门前关灯后,回头看一眼水池,结果见水池闪闪发光。因为养鱼缸的水也流到同一水池,他怀疑是鱼缸排 出的成分影响水母素,不久他就确定钙离子增强水母素发光。1963年,他们在《科学》杂志报道钙和水母素发光的关系。1967年Ridgway和 Ashley提出检测钙的新方法:用水母素。钙离子是生物体内的重要信号分子,水母素成为第一个有空间分辨能力的钙检测方法,是目前仍用的方法之一。

  1955年Davenport和Nicol发现水母可以发绿光,但不知其因。1962年下村修和约翰森那篇纯化水母素的文章中,有个注脚,说还 发现了另一种蛋白,它在阳光下呈绿色、钨丝灯下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性。1974年,他们得到了这个蛋白,当时称绿色 蛋白、以后称绿色荧光蛋白(GFP)。Morin和Hastings提出水母素和GFP之间可以发生能量转移。水母素在钙刺激下发光,其能量可转移到GFP,刺激GFP发光。这是物理化学中已知的荧光共振能量转移(FRET)在生物中的发现。

  下村修本人对GFP的应用前景不敏感,也未意识到应用的重要性。他离开普林斯顿到Woods Hole海洋研究所后,他的同事普瑞舍(Douglas Prasher)非常感兴趣用荧光蛋白做生物示踪分子。1985年普瑞舍和日裔科学家Satoshi Inouye分别根据蛋白质序列拿到了水母素的基因(生物学上准确地说是cDNA)。1992年,普瑞舍又拿到GFP的基因。有了cDNA,一般生物学研 究者就很容易应用,比用蛋白质方便多了。

  普瑞舍1992年发表GFP基因的文章后,离开科学界。原因是他申请美国国家科学基金时,评审者说没有蛋白质发光的先例,就是他找到了这种蛋白,也没什么价值。一气之下,他离开学术界去麻省空军国民卫队基地,到农业部动植物服务部工作。当时他如果花几美元,就可以做一个一般研究生都能做,但非常漂亮的工作:将来自水母的GFP基因放到其他生物体内(如细菌),看到荧光,可以很强烈地提示GFP本身可以发光,无需其他底物、或者辅助分子,也表明可以广泛用GFP。

  将GFP表达到其他生物体这项工作,1994年由两个实验室独立进行:美国哥伦比亚大学做线虫的Marty Chalfie实验室,和加州大学圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的两位日裔科学家Inouye和Tsuji。

  水母素和GFP都有重要的应用。但水母素仍是荧光酶的一种,它需荧光素。而GFP是蛋白质本身发光,原理上不同。

  Chalfie的文章立即引起轰动,很多生物学研究者接着纷纷将GFP引入自己的系统。当时好些《自然》、《科学》文章,证明哪里表达GFP,哪里就有绿光,这些后续文章不过是跟风,上了《自然》也不证明有原创性。

  1994年,华裔美国科学家钱永健(Roger Y Tsien)开始改造GFP,有多项发现。世界上目前使用的荧光蛋白大多是钱永健实验室改造后的变种,有的荧光更强,有的呈黄色、蓝色,有的可激活、可变色。用一些不常用做研究样本的生物找有颜色的蛋白成为一些人的爱好。不过真发现的有用东西并不很多。成功的例子有俄国科学院生物有机化学研究所 Sergey A. Lukyanov实验室从珊瑚里发现的其他荧光蛋白(FP),包括红色荧光蛋白。

  综观整个过程,从1961年到1974年,下村修和约翰森的研究遥遥领先,但很少人注意。单纯从技术上,其他生化学家也可以得到水母素和 GFP,但需要有想法或兴趣。在1974年以后,特别是八十年代后,很多后续工作显而易见,一般研究生可以做。其中例外是钱永健实验室发现变种出现新颜 色,这发现出乎意料。

  GFP之美丽和妙用

  GFP及其衍生物(各种荧光蛋白),绚丽多彩,非常漂亮。

  有些荧光蛋白当浓度足够高时,在日光下可以看到颜色。所以实验室产生了人为可控制颜色的鱼、老鼠。

  荧光蛋白广泛应用于生物学研究。可以通过常规的基因操纵手段,将荧光蛋白用来标记其他目标蛋白,这样可以观察、跟踪目标蛋白的时间、空间变化。 提供了以前不能达到的时间和空间分辨率,而且可以在活细胞、甚至活体动物中观察到一些分子。荧光蛋白技术也使得人们可以研究某些分子的活性,而不仅仅是其 存在与否。

  对于有些研究来说,荧光蛋白的作用可以形容为“起死回生”:原来有些方法,需要把生物变成死物才能研究一些现象和过程,而荧光蛋白为主要支柱之一的现代成像技术,使科学家在活的细胞中观察和研究这些过程,使一部分“死物学”变成“生物学”。

  为了好奇

  下村修1928年生于京都,长于长崎。1945年他16岁时,原子弹在他故乡爆炸,他曾失明数周。1951年,他毕业于长崎医科大学药学专门 部,1960年获名古屋大学有机化学博士。1960年他到美国普林斯顿大学约翰森实验室做博士后,63年至65年回日本名古屋大学任副教授,65年回普林 斯顿继续在约翰森实验室,直到1980年。估计是约翰森退休后下村修不能待在普林斯顿了,所以1980至2001年他到麻省Woods Hole海洋生物学研究所工作、并有波士顿大学兼职教授之软差。

  下村修1961年33岁做出重要发现(1962年发表),到1974年46岁时,全部关键实验完成。但到80岁的今年,他几乎是默默无闻。他多 年没有实验室,在约翰森实验室做了近20年博士后,不是为了功。他也没有当选美国科学院院士,不是为了名。GFP后来带来了相当的收益,但下村修没得,也不是为了利。

  下村修加入生物发光研究是1955年在日本做研究生时,导师让他到另外一个实验室去开阔眼界,而那个实验室的导师介绍他做荧光素。1959年导 师逝于癌症,1960年他到约翰森实验室。约翰森给他看水母发光,要他做,可是第一次演示根本没有发光。但下村修被约翰森感染了,决定做这个课题。 1961年约翰森开了七天的车、每天12小时,带下村修横跨美国到西海岸华盛顿州的“星期五港”(Friday Harbor)实验室,那里当时盛产水母,有很多原料,他们在1961年夏做出主要发现。

  下村修开始做研究时不知其重要性,只是对生物发光好奇。发光的生物学意义,至今尚不清楚;而发光蛋白应用的重要性,下村修不仅当时不知道,而且以后相当时间不清楚。水母素应用于检测钙,是1967年由Ridgway和Ashley提出。最初下村修和约翰森只为提取水母素,而GFP是副产物。现在,这个副产物的用途比原来的正产物还大。GFP作为示踪蛋白是普瑞舍极力鼓吹。广泛应用在1994年以后。从1974年获得GFP到1994年,下村修 并未大力推动GFP的应用。

  下村修乐于做这项工作,只需很基本的条件。2001年退休后,他继续做研究,把家里的地下室作为“光蛋白实验室”,今年80岁的他,还用家庭地址发表文章。

  科学界并不公平

  下村修有非常重要的科学贡献。但是科学界多半不知道他,只知道后续工作,社会的认可就更少。

  在普林斯顿,他二十年没有独立实验室,在别人领导下工作。到Woods Hole后,是很小的几人小组。他80岁了,也没有当选哪里的院士。最近几年开始获些不知名的奖。非常热衷于国民获诺贝尔奖的日本,到近年才有少数专家知道下村修。

  下村修和遗传学家Barbara McClintock不同。她在81岁因为发现转座子获诺贝尔奖。但慢的主要原因是学术,而对她个人很早就认可(因为在遗传学的多个贡献,1944年她 42岁时当选美国科学院院士,是最年轻的院士之一;43岁当选美国遗传学会主席)。1950年代,她提出转座是调控基因表达的重要机理,但转座调控基因并不是普遍规律。她在植物中发现转座现象,不是争议焦点,一旦大家意识到转座是普遍现象(包括动物)后,就接受了其重要性。而下村修的成果人们用了很多年, 没有争议,只是大多数人不知道他的个人贡献。

  下村修虽然做了非常原创性的工作,很多人用他发现的GFP,有些生物学杂志每期都有文章用GFP,有些生物杂志每期20%的文章用了GFP,但绝大多数人并不知道发现者是下村修。下村修和约翰森1962年发现水母素的文章迄今被377次引用,1974年纯化GFP的文章被引用169 次,Chalfie等1994年《科学》文章被引用3349次,Inouye 和Tsuji的1994年文章被引用256次。说明大多数科学工作者并不知道所用的东西怎么来的。所以,简单重视引用率也不能代替对领域的真正了解。

  不仅下村修没有被广泛认可,其他一些人也遭忽略。1990年,他的合作者约翰森82岁去世时,《纽约时报》的悼文没有提GFP。普瑞舍拿到GFP基因但缺经费。Chalfie文章引用率高但专利搞砸了没多少收益。

  我2002年写的值得获诺贝尔奖名单中,有普瑞舍和钱永健,无下村修。近年我才给学生讲下村修的工作。本文也算是一个更正。

  这个领域,最重要的工作显然是下村修和约翰森做的。钱永健在两个方面做出了重要的贡献,如果钱与下村修合得奖也很合理。第三重要的是普瑞舍。他承前启后,有助于推广应用下村修的发现。

  钱永健的贡献

  钱永健是取得重要成就的科学家。他在成像技术中,有两项重要工作都与下村修有一定关系。

  一项是钙染料。1980年钱永健发明检测钙离子浓度的染料分子,1981年改进将染料引入细胞的方法,以后发明更多、更好的染料,被广泛应用。 检测钙的方法有三种:选择性电极、水母素、钙染料。在钱永健的钙染料没有出现以前,具有空间检测能力的只有水母素,但当时水母素需要注射到细胞内,应用不方便,而钱永健的染料可以通透到细胞里面去。水母素和钙染料各有优缺点,目前用染料的人多。钱永健还发明了多种染料用于研究其他分子。

  钱永健的第二项工作是GFP。1994年起,钱永健开始研究GFP,改进GFP的发光强度,发光颜色(发明变种,多种不同颜色),发明更多应用方法,阐明发光原理。世界上应用的FP,多半是他发明的变种。他的专利有很多人用,有公司销售。

  钱永健的工作,从八十年代一开始就引人瞩目。他可能是世界上被邀请给学术报告最多的科学家,因为化学和生物界都爱听他的报告,既有技术应用、也有一些很有趣的现象。他1952年出生,年龄允许他等些年(而下村修没有这个优势)。所以,很多人多年认为钱永健会得诺贝尔奖,可以是化学、也可以是生理奖。值得指出,钱永健非常肯定下村修的工作,钱较早公开介绍下村修的发现。

  钱永健是钱学森的堂侄。他家多科学家和工程师。他中学时获得过西屋天才奖第一名,大学在哈佛念化学和物理,20岁毕业,后获英国剑桥大学生理学 博士。他哥哥钱永佑(Richard W Tsien)是神经生物学家,曾任Stanford大学生理系主任。两兄弟分别获Rhodes和Marshall学者奖(通常认为是美国大学生竞争性最强 的两个奖学金,克林顿总统曾获Rhodes),到英国留学,九十年代双双成为美国科学院院士。钱学森回国后,国内教育体系在他的子女应该上大学时受到极大 破坏,使钱的子女钱永刚、钱永真没有得到他们堂兄弟那样的发展环境。钱永刚出生于1948年,文革后才念大学。但愿钱永健在钱学森先生在世的时候获奖,告 慰他们全家。

  我在华盛顿大学有位同事,在神经生物学和现代成像都有重要发现和发明,他要求很高,批判性很强,公开发表文章批热门的领域、批很多人研究不解决问题。他也看不起一些诺贝尔奖得主。有一年刚宣布得奖名单,我到他办公室去聊天,他没等我开口,就说:“今天是不幸的一天”。他认为那些人没一个值得得 奖。这位批判性很强的人,却非常佩服钱永健。

  科学界还会有下村修吗?

  这个问题可以分几个方面讨论。

  当然可以问是否现代科学工作者,比较功利,能否象他那样抱着一个不知道重要性的东西,不追求资源、不追求认可,持之以恒,自得其乐。

  然后也可以问,如果碰到这样的人,谁会支持他?下村修和钱永健相差很大。钱永健是人们很快就知道有聪明资质的天才,支持他的人很多,他的工作出来马上为人所知。下村修基本是反例。没人认为他是天才,他不知道自己工作的重要性,别人也不容易在早期判断他的工作。普林斯顿就没有重视他,否则不会在约翰森退休后,让他走。实际上,当时的校长不仅不重视他,也不重视生物,当时一批普林斯顿的生物教授因此跑到旧金山加州大学。斯坦福和哈佛很会靠自己的名声 和经费实力招已经做出了可以得奖工作的人,但没有发现下村修。

  只有少数人会欣赏下村修,支持他做些事。如果要委员会投票表决是否支持他,大概多数委员会难以让他过关。但在科学界,需要有些人、有些机构、有 些时候敢于承担风险,支持少数下村修这样的科学家,做些开始看来稀奇古怪、不着边际的工作。成本其实相当低,主要是支持者不怕其他人的批评。其中多数这种人最后没什么结果,但是只要很少一些支持对了,对科学界的作用可以很大。

  对于学生来说,赶热门比较容易,但如果注意力不被大流所驱赶,而在如1970年GFP研究状态时加入这种领域,其实是很安全的重要课题,那时已经知道有绿色蛋白,主要是提纯。当然,能做1961年的工作更好,不过那要求就高很多。

  下村的故事完了吗?

  这个问题有两个含义。一是下村修。二是他儿子下村务。

  年逾80的下村修,无疑应该获诺贝尔奖。但是他是否能得到,却有较大疑问。首先诺贝尔奖委员会出错频率不低,近年也出过好几次。其次,诺贝尔化学奖委员会有时横炮打到生物里,或没搞懂全貌、或只从化学出发,把奖发给一个领域的某个人,而忽略了领域里其他人,甚至更重要的人。一类工作被奖后,其他 奖的委员会一般不愿再给同类工作发奖,这样造成一个领域最重要的人没得奖,而其他人得奖。这种现象,在下村修身上发生的可能性不小。过去十年,发过好几个 与GFP相关的奖,都没有下村修。只有很少几个不出名的奖近年给下村修。他是否能得诺贝尔奖,反映的不是他的水平,而是诺贝尔奖委员会的水平。化学和生理 两个委员会,是否能比平时水平高一点,还得拭目以待。目前化学奖委员会打错横炮的机率并不是0。过去5年,化学奖委员会发生物相关的奖出过三次错(近十年 生理奖也出过错,不过没有化学奖频率高)。人的评判无绝对客观,诺贝尔奖委员会也不例外。

  下村修既无名也无利。他儿子下村努(Tsutomu Shimomura)却很年青就成了名人。下村努是下村修1964年回日本期间出生于名古屋。后随父母回美国,长于普林斯顿,上普林斯顿高中。在加州理工 学院念大学时,跟过诺贝尔物理奖获得者费曼(Richard Feynman)。曾任职于加州大学圣迭戈分校的物理系和圣迭戈超级计算中心。

  下村努90年代协助联邦调查局抓住了一个有名的黑客,让那人坐了牢。1995年,他和记者以此为基础合写一本书Takedown(中文“骇客追 缉令”),书被改编成电影,很出名。有传说他小时候有逆反心理,后来也可能是黑客,在国会作证时,有联邦调查局探员在身旁,他也黑国会的通讯系统。

  所以,下村家的故事怎么落幕,还不清楚。

  “研三病”:对科学的幻灭和对科学家的悲观失望

  以前,一些崇拜科学的人,常把科学家看得比实际更伟大。而得了诺贝尔奖的科学家,也有隐去实情,在得奖后大谈对科学的热爱, 刻意淡化自己对获奖的重视。

  现在,做科学研究的人很多,认识科学工作者的人更多。人们发现科学界很多人并不崇高。原来一些得奖的人不仅热衷于获得认可,而且为了得奖去做很多学术政治,有的不断和评选委员会拉关系,有的到评奖机构蹲点“合作研究”,有的贬低其他人工作。还有些科学工作者做研究纯粹为了利益,对学术不感兴趣, 甚至造假。诸如此类,不一而足。

  这样导致了我称之为 “研三病”的问题:也就是一些水平相当于研究生三年级的人,对科学研究和科学家群体非常悲观,自认为看破科学界的红尘,愤世嫉俗,走向反面,认定为好奇而做科学的人早已灭绝,断言已经没有纯粹为科学而科学的科学家。

  有些科学工作者一辈子都摆脱不了这种病,看不到科学的美,看不到科学家追求美的品味和探索真理的高尚,这不仅影响他们自己的科学研究、动力、动机,而且描黑整个科学界,甚至成为科学界的不良分子。

  我近年在一些学校和研究机构讲“科学研究的动力”,总结有三种:好奇、敬业和求胜。为了免疫青年学子,不犯“研三病”、或者较早缓解,我既说明 确实很多科学家做科学的动力比较通俗,但也有科学家是好奇驱动。我希望通过下村修的故事,有助于犯“研三病”者明了每十年中生命科学都有几项非常重要的、 大家公认的发现和发明,从忧郁症中觉悟过来,潜心寻求好的研究方向,自强不息。

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  2008年10月4日写,2008年10月5日《科学网》,2008年10月6日《科学时报》发表。

  (编者注:本文发表两天后,2008年10月8日,文中介绍的下村修,钱永健,Chalfie获得诺贝尔化学奖)

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责任编辑:李阳阳

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