科学家使用两种CRISPR酶 仅用20分钟即可进行COVID-19诊断

　　据外媒报道，对COVID-19进行频繁、快速的检测对于控制疫情的蔓延至关重要，特别是在出现新的、更具传播性的变体时。虽然今天的标准COVID-19诊断测试（使用qRT-PCR）非常敏感，可以检测到每微升一个RNA拷贝，但它需要专门的设备、几个小时的运行时间和一个集中的实验室设施。因此，测试通常需要至少一到两天的时间。由加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna、David Savage和Patrick Hsu实验室的科学家领导的一个研究小组，旨在开发一种比qRT-PCR更快和更容易部署的诊断测试。

　　它现在已经将两种不同类型的CRISPR酶结合起来，创造出一种能够在不到一小时内检测出少量病毒RNA的检测方法。Doudna因开发CRISPR-Cas9 基因组编辑方法而获得了2020年诺贝尔化学奖。

　　虽然新技术还没有达到与qRT-PCR的灵敏度相媲美的阶段，qRT-PCR可以检测到每微升液体中仅有的几个病毒拷贝，但它已经能够拾取病毒RNA的水平--每微升约30个拷贝--足以用于监视人口和限制感染的传播。

　　研究共同作者、分子和细胞生物学教授David Savage说：“你不需要PCR的灵敏度来基本上捕捉和诊断社区中的COVID-19，如果测试足够方便和快速。我们的希望是尽可能地推动生物化学的发展，使你能够想象出一种非常方便的形式，在这样的环境中，你可以每天接受测试，比如说，在上班的入口处。”

　　研究人员于2021年8月5日在《自然-化学生物学》杂志上报告了他们的成果。

　　几种基于CRISPR的检测方法已被美国食品和药物管理局授权紧急使用，但所有这些都需要一个初始步骤，在这个步骤中，病毒RNA被放大，以便检测信号--涉及释放一种在蓝光下发光的荧光分子--足够亮，可以看到。虽然这种初始扩增将测试的灵敏度提高到与qRT-PCR类似的水平，但它也引入了一些步骤，使测试在实验室外更难进行。

　　由加州大学伯克利分校领导的团队试图在不牺牲检测的简单性的情况下达到有用的灵敏度和速度。

　　团队负责人、创新基因组学研究所（IGI）Doudna实验室的研究科学家Tina Liu说："对于护理点的应用，你希望有一个快速的反应，以便人们能够迅速知道他们是否被感染，例如在你坐飞机或去拜访亲戚之前，"IGI是一个以CRISPR为重点的中心，有加州大学伯克利分校和旧金山分校的科学家参与。

　　除了增加了一个步骤之外，初始扩增的另一个缺点是，由于它制造了数十亿份病毒RNA，因此在病人样本中出现交叉污染的机会更大。该团队开发的新技术将这一点翻转过来，转而增强了荧光信号，消除了交叉污染的一个主要来源。

　　这种无扩增的技术，他们称之为快速综合核酸酶串联检测（FIND-IT），可以对许多其他传染病进行快速和廉价的诊断测试。

　　Tina说：“虽然我们启动这个项目的明确目的是影响COVID-19，但我认为这种特殊的技术可以适用于不仅仅是这种大流行病，因为最终，CRISPR是可以编程的。因此，你可以给CRISPR酶加载一个针对流感病毒或HIV病毒或任何类型的RNA病毒的序列，并且该系统有可能以同样的方式工作。这篇论文真正确立了这种生物化学是一种更简单的检测RNA的方法，并且有能力在敏感和快速的时间范围内检测该RNA，这可能适合于未来在护理点诊断中的应用。”

　　研究人员目前正在利用FIND-IT建立这样一种诊断方法，这将包括收集和处理样本的步骤，并在一个紧凑的微流控设备上运行检测方法。

　　为了从方程中去除目标放大，该团队采用了一种CRISPR酶--Cas13--首先检测病毒RNA，而另一种称为Csm6的Cas蛋白则放大了荧光信号。

　　Cas13是一把用于切割RNA的通用“剪刀”；一旦它与由指导RNA指定的目标序列结合，它就会被激发去切割广泛的其他RNA分子。这种目标触发的切割活动可以被用来将特定RNA序列的检测与荧光报告分子的释放联系起来。然而，就其本身而言，当目标RNA的数量非常少时，Cas13可能需要几个小时才能产生一个可检测的信号。

　　Tina的见解是使用Csm6来放大Cas13的效果。Csm6是一种CRISPR酶，能感知小环状RNA的存在，并被激活以切割细胞中广泛的RNA分子。

　　为了提高Cas13的检测能力，她和她的同事设计了一个特别设计的激活剂分子，当Cas13检测到病毒性RNA时，该分子会被切割。这个分子的一个片段可以与Csm6结合并触发Csm6切割并从一段RNA中释放出一个明亮的荧光分子。通常情况下，激活剂分子会迅速被Csm6分解，从而限制了它能产生的荧光信号的数量。刘和她的同事设计了一种方法，对激活剂进行化学修饰，使其免受降解的影响，并能为Csm6“充电”，以反复切割和释放与RNA相连的荧光分子。这导致了比原始激活剂好100倍的灵敏度。

　　Tina说：“当Cas13被激活时，它切割这个小的激活剂，去除保护它的一段。现在它被解放了，它可以激活第二种酶Csm6的许多不同分子。因此，Cas13识别的一个目标不仅仅导致其自身的RNA切割能力被激活；它还导致产生更多的活性酶，然后每个酶都可以切割更多的荧光报告物。”

　　该研究小组还纳入了一种优化的引导RNA组合，使Cas13对病毒RNA的识别更加敏感。当这与Csm6及其激活剂相结合时，该团队能够在短短20分钟内检测到每微升低至31个拷贝的SARS-CoV-2 RNA。

　　研究人员还将从病人样本中提取的RNA加入到微流控盒中的FIND-IT检测中，以了解这种检测是否能够适应在便携式设备上运行。使用一个带摄像头的小型设备，他们可以检测从病人样本中提取的SARS-CoV-2 RNA，其灵敏度可以捕捉到COVID-19感染的高峰。

　　Tina表示：“这种串联核酸酶方法--Cas13加Csm6--将所有东西结合到一个温度下的单一反应中，即37摄氏度，因此它不需要高温加热或多个步骤，而其他诊断技术则需要这样。我认为这为更快、更简单的测试提供了机会，可以达到与目前其他技术相当的灵敏度，并有可能在未来达到更高的灵敏度。”

　　这种无扩增的RNA检测方法的开发源于IGI内部在大流行开始时对COVID-19的诊断和治疗问题进行的研究方向调整。最终，加州大学伯克利分校的五个实验室和加州大学旧金山分校的两个实验室参与了这个研究项目，这是IGI内部众多研究项目中的一个。