模拟“提绳打水”，破解多肽纳米孔测序瓶颈

　　这就相当于用绳子在井里提水桶，如果井是纳米孔的话，井绳就是DNA，水桶就是多肽。“井口”的DNA测序酶拉动DNA在纳米孔内移动，而DNA又与多肽嵌合在一起，DNA的移动，也就直接拉动了多肽的移动，从而实现了多肽的纳米孔测序。

　　黄硕 南京大学化学化工学院教授

　　蛋白质是构建生命体的基本物质之一，在合成、催化和信号传感等所有生命活动中均承担着重要的功能。开发一种可靠、高效的蛋白质测序技术对于理解生命过程、揭示疾病机理至关重要。作为构成蛋白质的组成片段——多肽成为打开蛋白质这扇大门的钥匙。

　　纳米孔测序技术是近年来新兴的一种单分子测序技术，其中多肽纳米孔测序仍面临诸多挑战。科技日报记者9月12日从南京大学获悉，该校化学化工学院研究团队在国际知名期刊《纳米快报》杂志发表论文称，他们利用纳米孔错位测序技术，像在水井里提绳打水一样，构建了多肽-DNA嵌合链，用DNA测序酶与DNA的结合，通过DNA的移动，带动多肽分子在纳米孔内的棘轮运动，从而破解了对多肽进行纳米孔测序的技术瓶颈。

　　现有蛋白质测序技术有缺陷

　　蛋白质是组成人体一切细胞、组织的重要物质，可以说，没有蛋白质就没有生命。而蛋白质的功能是由蛋白质的序列决定的，序列的微小改变，可能导致蛋白质失去生物活性或者诱发疾病。

　　如果我们能为蛋白质测序，就可以确定蛋白质是否有序列变化，从而判断其是否会对人类健康产生影响。

　　“与核酸检测不同，目前蛋白质测序的难点在于，缺乏有效的序列扩增方法，技术发展上停滞不前，主要靠质谱法和埃德曼降解法来测序。”该论文的通讯作者、南京大学化学化工学院教授黄硕说。

　　通俗地说，质谱法是用生物酶将蛋白质分解成很多多肽片段，再通过质谱仪器检测，确定蛋白质片段的信息，最终将这些片段重构成蛋白质序列。而埃德曼降解法是用化学方法将蛋白质N端的一个氨基酸切下来进行鉴定，然后再进行第二轮的氨基酸切割和鉴定，多次循环操作后，确定氨基酸的序列。

　　但在黄硕看来，这两个方法都有局限性。“相较于DNA和RNA测序，构成蛋白质的氨基酸种类更多，质谱法的检测难度大于核酸测序。而对埃德曼降解法来说，它只能对单一的蛋白质样品序列解析，如果降解的样品纯度不够，混合有多种蛋白质样品，那么被切下来的氨基酸就会有很多种，就无法确定哪个氨基酸来自哪个蛋白质，从而无法判断蛋白质的序列。另外，还有一些肽段的末端是封闭的，就不能用降解法。”黄硕介绍。

　　更重要的是，由于无法实现序列扩增，现有蛋白质测序技术的灵敏度较低，这意味着无法检测自然界中一些丰度很低的蛋白质样品。黄硕认为，现有技术难以对复杂环境中的蛋白质直接测序，比如体液、土壤、水体中的蛋白质样品，要先做一些纯化、富集，达到测序的样品标准，才能在质谱仪中测序。同时，蛋白质的化学修饰很丰富，这也有可能干扰蛋白质测序。

　　DNA“牵手”多肽“穿行”纳米孔

　　能不能找到一种更微观的测序方式，只用一个分子就能为蛋白质测序？从2015年开始，纳米孔测序技术进入黄硕课题组研究视野。

　　纳米孔测序技术是近年来新兴的一种单分子测序技术，已在DNA和RNA测序方面取得成功，它让单链的核酸穿过纳米孔，通过纳米孔内的检测器获得核酸链的碱基信息。

　　“如果能在单分子水平上为蛋白质测序，我们就能对低丰度蛋白和单细胞蛋白质组学进行更加灵敏的检测。”黄硕表示，他们课题组受此启发，开始研究如何用纳米孔技术，进行蛋白质或多肽的单分子测序。

　　但是纳米孔测序仍面临诸多挑战，其中一个主要的困难是如何实现多肽在纳米孔中可控的棘轮运动，而这主要缘于目前没有和肽链相匹配、有很强亲和力的多肽测序酶。

　　黄硕告诉记者：“棘轮运动指的是生物高分子贴着纳米孔的内壁，顺着同一个方向做匀速、定向运动，类似于附着在齿轮内壁上移动一样，这需要找到一种酶来控制多肽的运动速度。”

　　黄硕课题组在多轮尝试失败后提出纳米孔错位测序技术。“核酸的纳米孔识别位点和酶的反应位点，有一个固定的约14—15个碱基的错位，这就形成了一个测序窗口，可以利用这个不受酶反应限制的窗口，实现测序。”黄硕说。

　　纳米孔错位测序技术能否应用在多肽测序领域？在此次研究中，黄硕课题组将多肽和DNA嵌合成一条链条，嵌合链的DNA部分为“牵引链”，在检测过程中，DNA测序酶与DNA结合，通过拉动DNA部分，牵动整条链在纳米孔中的可控棘轮运动，实现多肽的纳米孔直接读取。

　　黄硕解释道：“这就相当于用绳子在井里提水桶，如果井是纳米孔的话，井绳就是DNA，水桶就是多肽。‘井口’的DNA测序酶拉动DNA在纳米孔内移动，而DNA又与多肽嵌合在一起，DNA的移动，也就直接拉动了多肽的移动，从而实现了多肽的纳米孔测序。”

　　黄硕介绍，经验证，多肽的纳米孔测序信号表现出高度的一致性和序列相关性，由单氨基酸替换引起的电流变化也能被清楚地检测到。通过将多肽的N端或C端与DNA驱动链进行偶联，实现了对多肽两端氨基酸序列信息的读取。

　　“这意味着，可以对蛋白质单分子进行测序，这为今后的蛋白质高通量测序及蛋白质重构，提供了一个全新的工具。”黄硕说，借助蛋白质序列研究，可以对蛋白质的功能进行预测，从而帮助理解、解释相关生命活动。