蛇为什么没有腿？按照《圣经》上的说法，这是它唆使夏娃吃下禁果所得到的惩罚。信仰上帝的人或许照单全收，但是科学家们并不愿意让那个他们从没见过的神来解释这个问题。一些研究者试图从蛇类基因组的演化中找到答案。在近日发表在《细胞》杂志上的文章中，加州大学亚历克斯·维塞尔（Axel Visel）团队的科学家们发现，DNA中仅仅十几个碱基的变化，就能决定“腿”的有无。
蛇有没腿，要问刺猬？
在脊椎动物的胚胎发育过程中，一类被称为“刺猬因子”的蛋白质发挥着至关重要的作用。当初在研究这些基因时，科学家发现，它们的突变会导致果蝇胚胎的畸形，使得果蝇幼虫表皮上的齿状突起变得密集——因为它们看起来实在很像刺猬，科学家也就以“刺猬”来命名这些基因了。人们目前共发现五种“刺猬因子”，这其中，得名于游戏人物“刺猬索尼克”的音猬因子（Sonic hedgehog，SHH）被证明对脊椎动物的四肢发育至关重要。而维塞尔团队的关注点，就与这个听起来有点中二的基因有关。
正常果蝇胚胎（上），“刺猬”基因hh突变的果蝇胚胎（中）和刺猬（下）。图片来源：itsokaytobesmart.com
音猬因子固然重要，也不能只靠自己来决定胚胎长什么样。围绕着这个基因，还有大量起调控作用的DNA片段左右着动物肢体的发育。其中，有一类特殊的序列能够与特定的蛋白质结合，从而促进基因的表达，这些序列被称为“增强子”。在四肢发育的过程中，音猬因子的表达受到一种名为ZRS的增强子控制。对于包括人类在内的许多脊椎动物而言，发生在这一增强子上的突变可能产生严重的畸形——只改变单个碱基的突变，就可能改变音猬因子的表达，让新生儿一只手上长出两只拇指。那么，在没有腿的蛇类中，ZRS怎样影响着音猬因子的工作？
“蛇化”的小鼠
维塞尔等人进行的第一步研究，是将缅甸蟒（Python molurus bivittatus）、红尾蚺（Boa constrictor constrictor）、眼镜王蛇（Ophiophagus hannah）、小斑响尾蛇（Crotalus mitchellii pyrrhus）、极北蝰（Vipera berus berus）和玉米锦蛇（Pantherophis guttatus）这六种不同蛇类的ZRS序列与其他12种脊椎动物进行对比。
在上述6种蛇中，缅甸蟒和红尾蚺的骨骼中可见后肢残余（蓝色），而其他4种蛇则完全无肢（紫色）。图片来源：参考文献[1]
他们发现，在相对原始、还留有后肢残余的蚺和蟒中，ZRS核心区序列与四条腿的蜥蜴还高度相似（共享80%序列），但在更高等的蝰蛇和眼镜蛇中，序列差异就大得多了。而常见的宠物蛇玉米锦蛇中，几乎不存在这样的核心区域。之前提到，ZRS序列调控着音猬因子的表达，在这个区域，即使是单个碱基的差异也可能会导致肢体发育方面的严重后果。那么，如此大规模的变异，看起来可能是蛇类“无脚”的原因。
为了验证自己的猜想，维塞尔团队利用小鼠（对，还是生物学家的好朋友小鼠）进行了一系列实验。他们用不同物种的ZRS替换下小鼠的ZRS，并检查它们在小鼠胚胎中的活性。他们发现，包括人、鸡乃至腔棘鱼等动物的ZRS在小鼠中都具有正常的活性，而6种蛇类中，却只有蚺的ZRS显示出了正常的活性。是因为ZRS活性的缺失，导致蛇没有像其他脊椎动物那样发育出正常的四肢吗？
维塞尔团队的研究人员将小鼠胚胎ZRS分别用人类（human）、蟒（python）、眼镜王蛇（cobra）和棘腔鱼（coelacanth）的ZRS进行了替换，并观察小鼠胚胎的四肢发育情况。图C显示这五种动物大致的演化关系，图D显示带有这些动物ZRS的小鼠胚胎中音猬基因（Shh
利用CRISPR基因编辑技术，维塞尔团队构造了ZRS缺失的小鼠胚胎，并用人、鼠、腔棘魚、蟒和眼镜王蛇含有的ZRS进行回补。18.5天后，只有带着蟒和眼镜蛇ZRS的小鼠胚胎未能正常发育出四肢。
将失去的腿夺回
到了这一步，维塞尔团队实际上已经找到了问题的答案：在演化过程中，蛇类ZRS的变异导致编码音猬因子的基因无法正常表达，最终让蛇类失去了四肢。但研究者还想再深入一点——到底蛇类的ZRS出了什么问题，才使得它失去了自己应有的功能？
在好奇心的驱使下，他们进行了又一轮的基因比对，这一次，他们将关键部分锁定到了更小的范围：跟其他12种四足动物及鱼类相比，所有参与比对的蛇类在ZRS的中心区域都有一段17个碱基对的缺失。
在长达数百个碱基对的ZRS核心区，这仅仅17个碱基的缺失随后被证明正是问题的关键。维塞尔团队将这17个碱基“插”回到含有蟒ZRS的小鼠胚胎中，两周后，本应“蛇化”的小鼠长出了健全的四肢。
蛇的祖先曾经像其他许多脊椎动物一样拥有四肢。但随着环境的变迁， 它们的四肢在长久的演化过程中逐渐消失。在这个过程中，ZRS的失效也许起到了推波助澜的作用。维塞尔的研究解释了蛇类可能如何通过基因层面的变化让自己失去四肢，而类似的机制可能会出现在那些同样没有四肢的动物上。然而与此同时，维塞尔也指出，ZRS上那缺失的17个碱基不会是导致四肢缺失的唯一原因，其他与肢体发育有关的序列必然也发生了变化。将一个功能健全的ZRS嵌回到蛇的基因组里，我们是否能看到蛇长回四条腿的样子？研究者表示怀疑。演化从来都是一个复杂的过程，要解释像“失足”这么大的事，人们无疑还需要在基因组上找到更多证据。
