两点一线 探寻细胞生命的“年轻因子”

　　在对生命本源的幻想中，人们总是前往隐秘之处寻找“不老泉”，而事实上，生命不老的秘密或许在它最小的单位中——

　　3月26日，我国科学家首次鉴定出使衰老间充质干细胞重获活力的“年轻因子”——多梳蛋白4（CBX4），并对其功能进行了验证，相关研究成果发布于《细胞报道》上。

　　几天后的4月1日，《公共科学图书馆·生物学》发表了同一科学家团队的另一个全新发现，首次在人间充质干细胞中确立了“年轻通路”——YAP-FOXD1，并证明该通路的激活可减轻细胞衰老及骨关节炎。

　　如果说前者是科学家团队在干细胞中发现了“不老泉眼”，那么后者的研究则是“两点一线”地确定了细胞生命的“青春之河”。

　　“该研究揭示了YAP-FOXD1通路在人干细胞去衰老及骨关节炎基因治疗中的作用与分子机制。”论文通讯作者之一、中国科学院生物物理研究所研究员刘光慧介绍，研究由中科院生物物理所刘光慧研究组同北京大学汤富酬研究组、中科院动物所曲静研究组合作完成，研究团队历经五年的努力从纵横交织的细胞基因调控网络中，证明了YAP-FOXD1通路的存在，并通过细胞和动物水平的实验证明了它的功能。

　　为癌基因“正名” YAP蛋白充当“年轻因子” 

　　YAP-FOXD1通路中最先撞入科学家视野的是YAP蛋白。网上搜索YAP蛋白的“简历”，可以发现，与它关系最密切的是一条被业内称为“河马通路”的Hippo信号通路。

　　“河马通路”的上游一旦接收到抑制生长的信号，经过一系列激酶磷酸化反应后，最终以磷酸化的形式作用于下游效应因子YAP蛋白，决定YAP蛋白的磷酸化与否。

　　如果不被磷酸化，没有磷酸化基团“尾巴”的拖累，YAP便能够轻易进入细胞核，进入基因调控的大本营。这时YAP扮演的是“传令官”，它在大本营里的出现引来基因的活跃，它会选择与自己的靶基因结合，“传令下去”，催促靶基因表达出相应的RNA和蛋白质，从而影响细胞的生命活动。

　　“我们首先找到了YAP，它是一个功能明确的转录辅助激活因子。”刘光慧说，在细胞核里YAP可以和它的转录因子“伙伴”TEAD结合，共同激活下游靶基因的转录。

　　YAP如果带上了磷酸化基团的“尾巴”，就会被阻滞留在细胞质中，YAP无法到细胞核中“传令”，下游基因的转录表达受到抑制，细胞增殖也会受到抑制。

　　有报道指出，如果YAP进行频繁“传令”、不受节制，将会让细胞无限制增殖，进而可能引发肿瘤，因此被认为是一种“癌基因”。

　　YAP的特性给了研究团队两个任务：一是从功能上证明，它的存在与否是否与细胞的“年轻态”相关；二是它如何把“命令”传递下去进而调控功能基因的功能呢？它的“接令员”是谁，之前有没有被其他科学家找到呢？

　　为回答第一个问题，团队从正反两个角度进行验证。“我们通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术，发现了一系列可以延缓人类间充质干细胞衰老的蛋白。这些蛋白敲除后细胞会出现加速衰老的表型。”论文第一作者、中国科学院生物物理研究所博士生付丽娜说，基因敲除的工作开始于人胚胎干细胞，通过导入3种不同质粒，研究团队让人干细胞基因组中负责编码YAP蛋白的那段基因发生缺失。

　　“敲除的基因组DNA大概是几千个碱基，虽然敲除几个碱基也可能使得YAP因子失去功能，但是很可能导致新的异常蛋白的产生，从而引入无法排除的因素。”付丽娜说。团队必须确保YAP基因的完全沉默。为此，他们对CRISPR/Cas9基因编辑技术进行了改良，使其能够对巨大的YAP基因位点进行较大片段的删除。

　　利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，团队获得了YAP特异性敲除的人胚胎干细胞，通过定向分化技术，将人胚胎干细胞定向诱导分化为间充质干细胞。“YAP缺失的人间充质干细胞表现出严重的加速衰老表型。”刘光慧说，YAP在维持人成体干细胞年轻态中发挥着关键作用，虽然YAP在某些肿瘤细胞中被证明具有“癌基因”的功能，但在人间充质细胞中却扮演着“年轻因子”的角色。

　　全新的“两点一线” 找到YAP蛋白“铁杆伙伴”和“接令员” 

　　YAP通过与转录因子TEAD的相互作用来启动下游基因的转录，也就是说TEAD和YAP是“铁杆伙伴”。此前研究发现，YAP和TEAD通过YAP的N末端和TEAD的C末端间相互作用形成蛋白复合物，该蛋白复合物在YAP介导的细胞增殖中发挥着关键性的作用。

　　团队的第二个任务是寻找YAP的“接令员”。“我们假设YAP的某个或某些靶基因介导了人间充质干细胞年轻态的调节。”刘光慧说，“通过系列实验，我们发现YAP可以转录激活FOXD1，这是一个新型的YAP靶基因，之前从未被报道过。”

　　叉头框（FOX）蛋白家族包含50多个转录因子，在胚胎发育、细胞周期调控、糖类和脂类代谢、衰老调节等多种生物学过程中发挥作用。FOXD1是其中一个转录因子。付丽娜解释，之前有报道指出FOXD1能调节器官发育，并具有促进细胞增殖和细胞重编程的活性。

　　“我们首先对YAP敲除的人间充质干细胞进行了RNA测序，进一步结合转录因子结合元件的预测，我们推断FOXD1可能是YAP的一个新型靶基因。”付丽娜说，随后，为了验证推断，团队利用染色质免疫沉淀（ChIP）方法“钓”出能够特异性地结合FOXD1启动子DNA的蛋白（即YAP），最终证明是FOXD1从YAP处接过“命令”，开启调节细胞“年轻化”的分子程序。

　　“YAP是上游，FOXD1是下游。它们是一对命运共同体。”刘光慧解释，随着细胞衰老，YAP和FOXD1的表达都发生了一致性下调。

　　或助力基因治疗 未来可有效干预衰老相关疾病 

　　从干细胞出发，发现机制机理，再回到细胞、生命体验证，“青春之河”的发现必须在生物体中证明自己的“魔力”。

　　“我们在三种细胞衰老模型中证明了YAP-FOXD1通路的去衰老作用，YAP或FOXD1的过表达能使衰老的人间充质干细胞重新获得增殖能力。”付丽娜说。另一方面，细胞实验的结果提示了过表达YAP或FOXD1可能使衰老的动物间充质组织（如关节）变得更加年轻。

　　团队接下来在动物身上实施了基因治疗。“我们在小鼠体内证明了YAP或FOXD1蛋白的过表达作为骨关节炎基因治疗方案的可行性和有效性。”刘光慧说，团队以慢病毒载体为基因导入媒介，将编码YAP或FOXD1蛋白的慢病毒注射到患有骨关节炎的小鼠的关节腔内。数周的YAP或FOXD1基因治疗均可显著降低关节软骨中衰老细胞的比例，有效抑制关节软骨退化及关节腔炎症，从多个方面改善骨关节炎的病理表型。

　　骨关节炎是典型的与细胞衰老关系密切的人类疾病。这些研究结果均证明，通过基因导入干细胞“年轻因子”，有望在未来治疗以骨关节炎为代表的衰老相关疾病。找对“不老泉眼”或者“青春之河”，将为基因治疗提供明确的标靶，最终对衰老相关疾病的干预提供有效的解决方案，并进行临床应用。